Production et purification des protéines

Production et purification des Pr

 Les protéines recombinantes : se servir d'un organisme pour produire la Pr; insertion du gène codant pour la Pr; Hôte : insecte, bactérie .....

Purification des Pr :

• Etudier les fonctions / activités
• Déterminer sa séquence
• Analyser ses propriétés biophysiques
• Déterminer sa structure
• Application industrielle et pharmaceutique

I. Production de protéines recombinantes :

• Disposer de l’ADN codant pour la protéine
• Insérer ce gène codant dans un hôte
• Multiplication de l’hôte et expression de la protéine voulue
• Extraire la protéine d’intérêt

A/ Disposer de l’ADN codant pour la protéine :

Source : disposer de l'ADN génomique de l'organisme produisant naturellement la protéine

Design et commander les Amorces : complémentaire avec la séquence d'intérêt

PCR : Pour l'amplification du gène voulu.

B/ Insérer ce gène codant dans un hôte :

Par un plasmide , coupure et collage dans le séquence du plasmique.

1)- Méthode « classique »

• Disposer de l’ADN génomique de l’organisme produisant naturellement la protéine
• Design et commande des amorces
• PCR (Polymerase Chain Reaction) pour amplifier le gène voulu
• Digérer le produit PCR et le plasmide d’arrivée avec les enzymes de restriction
• Ligation des produits digérés
• Séquencer le plasmide pour vérifier la bonne insertion du gène codant

2)- Méthode « moderne »

Commander un gène synthétique directement inséré dans un plasmide au choix

* Transformation des cellules compétences par un plasmide recombinant : insertion du plasmide dans la bactérie ( par exemple) par un choc thermique ou Electroporation.

* Sélection des Bactérie infecté par le plasmide par la mise en culture en milieu solide contenant un Antibiotique que la bactérie est devenu résistante par le plasmide.

C/ Multiplication de l’hôte et expression de la protéine voulue:

• Sélection d'une colonie sur milieu solide avec ATB X
• Transfert de la colonie à un milieu ( pré culture) avec ATB X
• Transfert de la pré culture dans un volume plus important
• Induction : lancement de l’expression de la protéine d’intérêt :

Dans le plasmide recombinant, le gène d’intérêt est placé après un promoteur au sein d’un opéron : l’expression de la protéine voulue et des protéines placées après ce promoteur est régulée

Avant induction : les bactéries de la culture se multiplient mais la protéine voulue n’est pas exprimée à cause d’un répresseur qui empêche la transcription (il bloque l’accès de l’ARN polymérase à l’opérateur)

Après induction : l’inducteur se lie au répresseur qui change de conformation et libère ainsi l’accès à l’opérateur. La transcription des gènes de l’opéron par l’ARN polymérase peut alors avoir lieu. La production de la protéine d’intérêt commence

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