TP de biochimie : purification, dosage et séparation des acides aminés de la caséine

Purification, dosage et séparation des acides aminés de la caséine

(résumé)

Le but du TP était de séparer la caséine des autres constituants du lait en réalisant une précipitation au point isoélectrique;de doser la concentration en caséine en effectuant un dosage colorimétrique par le réactif de Folin; et aussi d’identifier la composition des tripeptides obtenus après l’hydrolyse partielle de la caséine. On a pu séparer la caséine après purification avec un rendement de 1,38. Celui-ci étant supérieur à 1, la purification n’etait donc pas totale. La concentration molaire en caséine était de 3,6.10-4 mol/L. La CCM a révélé que le premier tripeptide ME1 était Ser-Ala-Phe et que le second ME2 était His-Pro-Val.

(introduction)

Afin de travailler sur la caséine (protéine se trouvant dans le lait) il fallait l’isoler des autres constituants. La précipitation isoélectrique nous a permis de l’isoler car à ce pH les molécules de caséine sont globalement neutres ne se dissouent donc plus et vont donc s'agréger plus facilement puisqu’il n’y a plus de répulsion et former un culot récupérable après centrifugation.

Il fallait déterminer la concentration en caséine en quantifiant une molécule constitutive (la tyrosine). Le dosage colorimétrique par le réactif de Folin permet de doser facilement la tyrosine libre (acide aminé constitutif de la caséine). Le réactif de Folin réagi en fait avec les noyaux phénalique des tyrosines libres en l’a réduisant (en lui cédant des atomes d’hydrogène) ce qui lui donne une coloration bleue.

L’hydrolyse de la caséine étant incomplète, nous avons séparer des acides aminé constituants les tripeptides provenant d’hydrolysat de caséine en réalisant une chromatographie de partage (CCM). Cette chromatographie consiste à séparer des acides aminés en fonction de leur hydrophobicité soit de leurs plus ou moins grande affinité avec le solvant apolaire (phase mobile) ou la du support polaire (phase stationnaire). Plus les acides aminés ont d’affinité pour la phase apolaire (mobile), plus ils migrent sur le support; plus les acides aminés ont d’affinité pour la phase polaire (stationnaire), moins ils migrent.

(Résultat)

Le culot de caséine obtenu après précipitation et un séchage d’une durée de 24 heures avait une masse de 0,71g pour 20mL de lait. Ramené à 1000mL nous avons obtenu une concentration massique expérimentale de 35,5 g/L. Le calcul de la concentration massique théorique (sachant qu’il y a 80% de caséine dans le lait) mène au résultat de 25,5 g/L. Nous avons alors obtenu un rendement égal à 138% pour notre préparation.

Pour le calcul de la concentration des caséine dans la solution, nous avons pu lire sur la courbe d’étalonnage donnant l’absorbance à 700 nm en fonction des concentrations connues en tyrosine (voir en annexe)

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