Extraction et purification : Lysosyme

Compte-rendu de la séance de travaux pratiques  ‘‘ extraction et purification d’une enzyme : le lysozyme ’’

par Nathalie Ulysse

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Le lysozyme, ou encore muramidase, est une protéine enzymatique présente chez de nombreuses espèces animales, dans le sérum sanguin et les secrétions comme la salive ou les larmes, ainsi que dans l'albumen de l'oeuf dont il est extrait à des fins industriels. Son action bactéricide repose sur l’ hydrolyse d’une liaison spécifique du peptidoglycane de la paroi bactérienne, provoquant ainsi la lyse et la mort des bactéries majoritairement du type Gram + et, dans une moindre mesure, du type Gram – en raison de la moindre accessibilité de la paroi de ces dernières. Cette propriété fait du lysozyme une enzyme d’intérêt couramment utilisée dans l’industrie pharmaceutique et agro-alimentaire pour maîtriser le développement des populations bactériennes, par exemple dans la conservation des aliments (conservateur E1105) ou encore en tant qu’auxiliaire technologique en fermentation (Nau et coll.,2010)^[1].

Cette séance nous a permis d’expérimenter plusieurs stratégies courantes pour l’étude des protéines enzymatiques : Extraction et purification d’une protéine par centrifugation et fixation sur une échangeur ionique, mesure de l’activité enzymatique, contrôle de la pureté des produits obtenus.

1. Principe de l’extraction avec purification progressive

Le blanc d’oeuf contient majoritairement de l’eau à 87,6 % et des protéines à 10,8 % (^[2]), ces dernières représentant plus de 90 % du poids total en matières sèches. Le lysozyme constitue de 3,4 à 8 % de ces protéines (selon les publications^[3]) et à le point isoélectrique le plus haut (≈10,7) parmi celles-ci, c’est donc une protéine très basique. Les propriétés de masse et de charge servent de base à la purification. L’ extraction du blanc d’oeuf se fait en plusieurs étapes :

- La première étape repose sur l’adsorption du lysozyme à la surface d’une matrice solide de carboxyméthylcellulose chargée négativement. La dilution préalable du blanc d’oeuf dans un tampon pH 10 fait que les protéines autres que le lysozyme sont désormais chargées négativement, ayant toutes un pI inférieur à 10. Le lysozyme se lie ainsi à la surface de la résine de CM cellulose par des liaisons faibles électrostatiques. Après un temps de repos et d’agitation douce permettant ces interactions, une première centrifugation permet de fractionner le mélange en 2 phases, le surnageant et le culot. Le surnageant S1 contient une première fraction de protéines chargés négativement avec les autres constituants de l’albumen, le culot concentre le lysozyme lié au CM cellulose et les autres protéines concentrées à la centrifugation par leur masse.

- La deuxième étape est dite de lavage du culot à l’aide d’une solution tampon de pH 10 suivie d’une centrifugation. On vise ainsi à récupérer, avec le surnageant S2 obtenu, les dernières protéines chargées négativement.

- Une dernière étape de désorption permet le décrochage du lysozyme du CM cellulose par ajout de NaCl à 0,5 g/L qui, introduit en solution, se dissout en libérant des ions Cl- et Na+. Les ions Na+ entre en compétition avec le lysozyme et, ayant une plus forte affinité avec le CM cellulose que le lysoszyme (force ionique supérieure), ils se substituent à celui-ci sur le CM cellulose en se liant par des liaisons plus fortes énergétiquement. Après centrifugation, le lysozyme désormais libre de la CM cellulose, doit se retrouver dans le surnageant.

B est le filtrat brut de blanc d’oeuf en solution tampon. Si le protocole a été réalisé correctement, S1 contient un mélange de protéines chargés négativement, d’eau, de glucides et d’oligoéléments, S2 les dernières protéines anioniques, et L le lysozyme pur.

1. Dosage colorimétrique des différentes fractions

1. Principe

Il s’agit de doser la concentration en protéine des 4 fractions d’intérêt par spectrophotométrie (Figure 2 ^[4]. Le spectrophotométrie permet de mesurer le pic d’absorbance des solutions d’un rayonnement de longueur d’onde de 595 nm.

 L’absorbance est liée à la concentration par la loi de Beer-Lambert, il est donc possible d’en déduire la concentration en protéine selon : A= εcℓ où ε est le coefficient d'atténuation molaire, ℓ est la longueur du trajet parcouru par la lumière dans le milieu considéré et c la concentration en protéine. La mesure est indirect car, les solutions à mesurer ne possédant pas de pic d’absorption propre, il est nécessaire d’ajouter un réactif colorée (bleu de Coomassie) qui réagit avec les acides aminées composant les protéines, majoritairement l’arginine.

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Nous déduisons la concentration en protéine des différentes fractions en indexant l’absorbance mesurée sur celle d’une gamme étalon réalisée par une série de dilution qui contient, pour un même volume, une quantité croissante d’une protéine de référence de concentration connue, le sérum albumine bovin (BSA).

Le réactif colorée est ajoutée au même moment dans la gamme étalon et les 4 fractions à analyser afin que la la coloration se développe dans les mêmes conditions (obscurité et temps de repos minimal de 15 minutes).

Cette méthode de dosage colorimétrique des protéines, inventée par M. Bradford, est une des 3 méthodes de référence pour le dosage des protéines. Simple et rapide, elle présente une grande sensibilité permettant de doser des concentrations faibles, mais présente quelques désavantages que nous discuterons après la lecture des résultats.

1. Résultats

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Calcul quantité de protéine : Cm final = Cm initial x Vinitial / Vfinal.

Quantité de protéines (en g) = Cm final x Volume final

Exemple pour le tube 1 avec Cm initial à 1 g/L (= 1 µg/µL)  : Cm final = 1 x 20/100 = 0,2 g/L

La quantité de protéines dans le tube 1 est donc de 20 µg.

(remarque : zéro analytique réalisée sur un solution de 100 µL de tampon et 5 µL de bleu de Coomassie afin d’éviter de retrancher l’absorbance du colorant non complexé avec le BSA dans nos calculs).

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               Zone d’extrapolation de la droite de régression

Remarque : le coefficient de détermination R2 indique une très bonne qualité de la régression linéaire.

- B : L’absorbance moyenne à 595 nm est de 0,052 ce qui correspond à 60 µg pour une dilution au 1/10e et donc à 600 µg dans 100 µL de solution avant dilution (60x10) soit :

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