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Extraction et purification de l'ADN

TD : Extraction et purification de l'ADN. Recherche parmi 297 000+ dissertations

Par   •  22 Octobre 2017  •  TD  •  1 070 Mots (5 Pages)  •  4 603 Vues

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Extraction et purification de l’ADN génomique

Introduction : L'extraction de l'ADN est une technique permettant d'isoler l'ADN de cellules ou de tissus. L'ADN ainsi extrait peut ensuite être utilisé pour des recherches de biologie moléculaire, telles que le séquençage, la PCR ou le clonage. Il existe différents protocoles pour extraire l'ADN, qui suivent approximativement le même schéma de principe :

  • Lyse des cellules bactériennes
  • Elimination des protéines
  • Elimination des autres acides nucléiques (ARN...)
  • Concentration de l'ADN par précipitation à l'alcool

But

L’objectif de ce TP est d’acquérir quelques techniques de base de la biologie moléculaire. Dans un premier temps une extraction et purification de l’ADN génomique sera réalisée sur une bactérie Gram+ et -. Par la suite un profile électrophorétique sur gel d’agarose sera effectué pour vérifier la présence de l’ADN purifié.

Extraction de l’ADN génomique

L’extraction de l’ADN génomique sera réalisée sur une bactérie Gram+ et Gram –

Différence entre les bactéries Gram+ et Gram- :

[pic 1]

[pic 2]

Première étape : lyse cellulaire

EDTA : a pour rôle de fragiliser la membrane cellulaire et inhibe les métalloenzymes

Protéinase K : digestion des protéines et des cellules

Solution de lyse : constituée de détergents, permet de lyser les cellules  (lyse chimique)

En mélange au vortex également pour favoriser la lyse cellulaire (lyse mécanique)

Incubation à 80 °C : lyse thermique

L’ajout de l’RNase permet la digestion de l’ARN qui est un contaminant de l’ADN

Deuxième étape : la précipitation des protéines permet d’éliminer les protéines se trouvant dans le lysat qui sont également des contaminants de l’ADN car elles possèdent un PM élevé.

3ème étape : précipitation et réhydratation de l’ADN

L’ajout de l’isopropanol permet de précipiter et de déshydrater la molécule d’ADN (ce qui permet la formation de la pelote blanche)

L’ethanol permet de laver  notre molécule d’ADN

Et enfin la solution de réhydratation va réhydrater l’ADN en apportant des molécules d’eau.

Electrophorèse sur gel d’agarose

L’électrophorèse avec la chromatographie est la technique la plus utilisée en biochimie pour la séparation et la caractérisation des molécules.

La technique de l'électrophorèse sur gel d'agarose est basée sur la séparation des acides nucléiques chargés négativement sous l'effet d'un champ électrique. Cette séparation s'effectue à travers la matrice du gel d'agarose : les molécules de plus petites tailles se déplacent plus rapidement et migreront plus loin que les molécules de tailles supérieures. Diverses macromolécules biologiques importantes (ex.: acides aminés, peptides, protéines, nucléotides et acides nucléiques) possèdent des groupes ionisables qui, à un pH donné, se transforment en espèces chargées électriquement sous forme tantôt de cations (+), tantôt d’anions (-). En fonction de la nature de la charge du réseau, les particules chargées migreront soit vers la cathode, soit vers l’anode. À titre d’exemple, lorsqu’un champ électrique traverse un gel de pH neutre, les groupes de phosphates chargés négativement de l’ADN provoquent la migration de celui-ci vers l’anode (Westermeier, 1997). L’électrophorèse à travers l’agarose est une méthode utilisée de façon standard pour séparer, identifier et purifier des fragments d’ADN. La technique est simple et facile à réaliser et peut dissoudre des fragments d’ADN que d’autres procédures ne permettent pas de séparer correctement. La position de l’ADN dans le gel peut, par ailleurs, être déterminée en teintant celui-ci avec une faible concentration de bromure d’éthidium, un fluorochrome s’intercalant entre les bases de l’ADN. Le bromure d’éthidium est un mutagène/carcinogène puissant et modérément toxique. Veillez à toujours porter des gants lors de la manipulation de solutions et de gels contenant du bromure d’éthidium.

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