Extraction d'ADN à partir de la banane

Compte rendu de TP (sur 60 points)

EXTRACTION D’ADN A PARTIR DE LA BANANE 

Cette fiche vous sert de trame pour la rédaction de votre rapport. Vous pouvez modifier le fichier word, mais l’ensemble de votre travail ne doit pas excéder 5 pages.

Chaque fiche doit être complétée par le binôme (ou trinôme) et devra comporter impérativement les points suivants :

Noms et prénoms : Gourbi Médina et Beche Mathilde

Séquence / Groupe : 3A1

Date du TP :  01/04/2025

Nom de l’encadrant : Kassandre Combet 

1/ BUT du TP (5 points)

Le but du TP est d’extraire de l’ADN de banane et, grâce à ses propriétés physico-chimique, notamment son absorbante dans l’UV, de permettre sa quantification. Enfin cela nous permettra de déterminer la quantité d’ADN contenue dans 1g de banane.

2/ PRINCIPES DES TECHNIQUES UTILISEES

Expliquer : 1) Le principe d’extraction et de précipitation de l’ADN et 2) La loi de Beer-Lambert (10 points)

• Principe d’extraction et de précipitation de l’ADN

L’extraction de l’ADN repose sur plusieurs étapes : Dans un 1er temps, broyer la banane mécaniquement (mortier) et chimiquement (à l’aide du tampon TE 1X), ce qui permet d’homogénéiser le tissu et de libérer les cellules. La 2ème étape consiste en la lyse cellulaire, l’utilisation d’un détergent, le SDS, pour dissoudre les membranes cellulaires et nucléaires et ainsi libérer l’ADN, qui est initialement contenue dans le noyau. L’ajout de NaCl permet ensuite de détacher l’ADN de ses protéines telles que les histones. Enfin, pour récupérer l’ADN, il faut le précipiter. Comme l’ADN est insoluble dans l’éthanol froid, il forme une « méduse » visible. Après rinçage à l’éthanol 70%, il faut réaliser une dilution afin de mesurer son absorbance au spectrophotomètre et ainsi quantifier l’ADN extrait.    

• La loi de Beer-Lambert 

La loi de Beer-Lambert permet de déterminer, grâce à l’absorbance (dans ce cas ci), la concentration d’ADN dans la solution. Elle exprime la formule suivante :[pic 1]

 La concentration de l’ADN est donc quantifier par spectrophotométrie en mesurant son absorbance entre 260 et 280 nm.

3/ RÉSULTATS ET INTERPRÉTATION

Pour bien réaliser cette partie vous avez besoin de connaitre la masse du morceau du banane initial et le volume du filtrat V1 : [pic 2]

Masse du morceau de banane : 3632,2mg = 3,6322g

Volume du filtrat V1 : 13mL

• EXTRACTION DE L’ADN DE LA BANANE :

1. Calculez le volume nécessaire de SDS 10% à ajouter au filtrat V1 pour que la concentration finale de SDS soit de 1%. (5 points)

Ci= 10%                                 CiVi=CfVf

Cf= 1%                        => 10 x Vi = 1 (V1+Vi)

Vf= V1+Vi mL                => 10 x Vi = 13 + Vi

                                        => 10 x Vi – Vi = 13

                                => 9 Vi = 13

                                 => Vi = 13/9 = 1,444mL

En théorie, il faudrait ajouter 1,4444…mL de SDS 10%. En pratique, on a ajouté 1,44mL de SDS 10%.  

1. Calculez la concentration finale de NaCl après avoir ajouté au filtrat V1 : le SDS 10% et la moitié du volume du filtrat V1 de NaCl 5M (5 points).

Ci= 5M                        CiVi=CfVf

Vi= V1/2 =13/2=6,5mL        => Cf= CiVi/Vf

 Vf= V1+VSDS+Vi                => Cf= (5 x 6,5) /20,94

     = 13 + 1,44 + 6,5                => Cf= 1,55 mol.L-1

     = 20,94mL

La concentration finale de NaCl après ajout de SDS et de la moitié du volume du filtrat V1 de NaCl est de 1,55mol.L-1.  

1. Est-ce que les traitements réalisés avec le SDS et leNaCl provoquent la fragmentation de l’ADN de la banane ? Justifiez votre réponse et nommez 2 procédures ou techniques qui fragmentent l’ADN (5 points).

Le SDS est un détergent qui provoque la rupture de la membrane plasmique et de l’enveloppe nucléaire. Dans le noyau, la molécule d’ADN, chargée – est liée aux histones chargés + ; l’ajout de Na+Cl- va déstabiliser les liaisons ADN-histones, et ainsi isoler l’ADN. Le SDS et le NaCl ne provoquent donc pas la fragmentation de l’ADN de la banane, mais permettent son extraction. Pour fragmenter l’ADN, on peut utiliser des enzymes de restriction tels que EcorI, PstI ou EcoRV. Des rayons X ou gamma peuvent aussi provoquer des cassures dans l’ADN.

• ANALYSE         D’UNE DES PROPIETES PHYSICO-CHIMIQUES DE L’ADN : L’ABSORBANCE DANS L’UV :

Pour réaliser correctement cette partie vous avez besoin de mesurer l’absorbance de la solution finale d’ADN de banane et du tampon TE 1X à 260 nm et 280 nm, vous pouvez compléter le tableau de valeurs suivant (5 points) : [pic 3]

1. Calculez le rapport d’absorbance A260/A280 et donnez vos conclusions sur le degré de pureté de votre extrait d’ADN (5 points).

Astuce : Pour des solutions d’ADN pures, le rapport d’absorbance A260/A280 est compris entre 1,8 et 2. Si ce rapport est inférieur à 1,8 l’extrait d’ADN est contaminé par des protéines. Si en revanche le rapport est supérieur à 2, l’extrait d’ADN est contaminé par de l’ARN.

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