Etude du métabolisme de Gln sur le processus de différentiation cellulaire

Emmanuel RAHANITRINIAINA                Assamal Kadio

Ines BERRADAS

Etude du métabolisme de Gln sur le processus de différentiation cellulaire

1. Introduction :

La protéine mTork est une protéine liée à la voie anabolique percevant le déficit en énergie dans la cellule ( ratio ATP/ADP) ; elle joue ainsi dans la croissance cellulaire et de la différentiation de la cellules vers le phénotype adipocytaire.

La question que l’on peut se poser la problématique suivante : quel est l’impact de la Glutamine sur le processus de différenciation cellules

Le but de se TP est ainsi de voir par qu’elle sont les acteurs de la synthèse de la protéine ainsi que de voir leur impact dans la voie métabolique. En plus, le but étant de se familiariser avec ma technique t western blot et ainsi voir l’expression de la protéine dans plusieurs conditions.

*On vera l’activité de mTork par le dosage de la phosphorylation des substrats de la protéine :

Qui sont : P7056K (phossphorylé) et 4EEBP1 (non phosphorylé)

*on mesurera aussi les facteurs des phénotypes adipocytaires : ° PAP

° CD35

°FAS

°Tubulin

1. Matériel et méthode :

1. Extraction des cellules :

Les cellules sont traitées dans 5 conditions différentes :

Condition contrôle : DMSO

Condition MSO

Condition MSO+ Glutamine

Condition MSO+ kétoglutarate

Condition GLN +CB839

Nous allons réaliser une lise avec le RIPA Buffer : qui contient des détergents et de

On dispose ainsi ul de buffer dans les cellules on centrifuge et on récupère le surnageant avec les protéines cellulaires.

1. Dosage de protéine :

1. Principe :

Pour doser les protéines nous allons utilisé la méthode du BCA ;

Le principe de cette méthode est  que, les ions Cu2+  sont réduit par les protéines présent dans l’échantillon en Cu+ ; ce Cu se complexe ainsi avec la molécule de BCA , ce qui donne un complexe coloré qui est mesurable sur un spectrophotomètre ,sur un lecteur de plaque à 5 nm.

1. Western blot :

1. Principe :

Le Western blot est un moyen de te détecter l’expression d’une protéine ainsi que de la quantification dites relative cette dernière.

Le western Blot se base sur le SDS Page, qui est la séparation des protéines en conditions dénaturante sur un gel de polyacrylamide. Les protéines dénaturés sous le courant électrique, se déplacerons de la borne + vers la borne - ; et les mailles du gel séparera les protéines selon leur taille, ralentissant les grosses protéines et laissant passé ce de petite taille.

Ensuite on transfert sur une membrane, pour pouvoir faire la révélation immunochimiques (des anticorps spécifiques à la protéine d’intérêt sera fixé par un autre anticorps qui lui possède une enzyme qui permettra d’avoir de la chimiluminescence.

1. Les étapes :

1. Migration des protéines sur le gel

• Nous allons d’abord dénaturer les protéines et avoir un marqueur visuel grâce au buffer LAEMMELI : qui contient des agents détergeant notamment

SDS : qui linéarise les protéines et lui apporte une charge négative

Bêta-mercaptoethanol : coupant les ponts disulfures et agit en même temps que le SDS

 Il contient aussi du Bromophenol Blue qui permettra de voir l’avancer de la protéine lors de la migration.

• Les protéines ainsi dénaturer on les déposera dans notre gel de polyacrylamide, nous disposons de gel pré couler.

Ce gel est un gel en 2 phase, une phase en Acrylamide à 10% qui permettra de concentrer les protéines, et la 2 ème phase est un gel en Bis acrylamide à 10% ce qui va permettre la séparation.

• Pendant le dépôt il ne faut oublier de mettre le leaner ou « Marqueur de taille »

Ce sont des protéines de différentes tailles, mais connu. Le leaner est donc notre référence de taille pour les protéines, on l’utilisera pour déterminer la taille des fragments

• Le gel sera placé dans une cuve et subira le courant électrique de 140 V en courant contenu
• Le dépôt étant réalisé on laisse le courant run pendant 1 heures.

1. Transfert

• La séparation étant réalisé on passe à l’étape de transfert :

Le transfert se fait sur des membranes qui ont une forte affinité avec les protéines et qui permette une fixation forte. Il y a plusieurs choix possibles, les plus utilisés sont la membrane nitrocellulose (polysaccharide) et la membrane PVDF. La membrane de PVDF est beaucoup plus stable et à une affinité plus forte avec les protéines que la nitrocellulose, mais le coup de la nitrocellulose est plus accessible.

Ainsi pour notre manipulation nous allons utiliser la membrane de nitrocellulose.

     Le transfert se déroule de la manière suivante pour notre machine (chaque appareil ayant ses propres réglages pour le transfert) :

Mais le principe est que : on pose le gel et la membrane et un papier entre l’anode et la cathode (du kit) et on pose une éponge imbiber du tampon de transfert

Le courant électrique avec le tampon fera migrer les protéines du gel, sur la membrane, le papier permettra le transfert par capillarité.

Quand le transfert a été réaliser, pour vérifier que le transfert à bien marché on fera une coloration au Rouge de ponceau.  C’est un colorant qui révèle de manière aspécifique toute les protéines présentes sur la membrane.

= C’est une vérification qualitative de la migration, et permet de voir si le bruit de fond est important, ou s’il y a formation de bulle durant le transfert.

On lavera ensuite avec TBS tween : c’est un tampon salin avec du détergeant, qui couperons les liaisons non covalentes des protéines non fixées non spécifiquement à la membrane

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