TP Biologie moléculaire
Compte rendu : TP Biologie moléculaire. Recherche parmi 298 000+ dissertationsPar CamDance • 21 Avril 2020 • Compte rendu • 3 347 Mots (14 Pages) • 1 722 Vues
TP BIOLOGIE MOLÉCULAIRE
Séparation d’ADN par électrophorèse analytique et préparative
- Objectif du TP
Le but de ce TP est de préparer et d’extraire l’ADN plasmidique pUC18-wzc à partir d’un culot d’Escherichia coli, d’établir sa carte de restriction grâce à sa digestion par des enzymes de restriction et enfin d’isoler et purifier le fragment d’intérêt EcoR1/BamH1 par électrophorèse sur gel d'agarose.
- Principes
- Extraction d’ADN plasmidique pUC18-wzc à partir d’Escherichia coli : La minipréparation du plasmide est réalisée à partir d’un culot, contenant des milliards de bactéries, grâce à l’ajout successif de différentes solutions permettant, entre autres, de séparer les ADN génomique et plasmidique et d’éliminer les protéines et les ARN. Pour séparer ces composés, des centrifugations sont effectuées. Il s’agit d’une technique préparative consistant à séparer des composés d’un mélange en fonction de leur densité ;
- Électrophorèse sur gel d’agarose : Cette technique est utilisée pour établir la carte de restriction, en soumettant le plasmide à des enzymes de restriction. Elle permet de séparer des fragments d’ADN chargés négativement en fonction de leur masse moléculaire. La révélation des migrations est réalisée sous UV grâce à l’ajout du bromure d’éthidium, agent intercalant. Grâce à un marqueur de tailles connues, nous pouvons tracer Log(Nombre de paires de bases)=f(Distance de migration) qui définit la résolution de notre gel ;
- Isolement et purification du fragment EcoRI/BamHI : À la suite de l’électrophorèse, nous récupérons et purifions le fragment d'intérêt wzc grâce à une chromatographie échangeuse d’ions. La phase stationnaire de la mini-colonne est recouverte de cations qui vont interagir avec les groupements phosphate (négatifs) de l’ADN et le reste sera élué.
- Résultats
- CARTE DE RESTRICTION
Nous avons procédé à la digestion du plasmide pUC18-wzc portant le fragment d’intérêt wzc par les enzymes de restriction SalI et PvuI. Parallèlement, nous avons effectué les doubles digestions, c’est à dire que nous avons fait agir deux enzymes simultanément, suivantes : SaII + PvuI / SalI + MluI / PvuI + MluI / EcoRI + Bam HI. Nous avons utilisé le marqueur moléculaire « ADN ladder λ EcoRI – Hind III » (Cf. ANNEXE 2). Ensuite, nous avons effectué la migration des fragments de restriction sur gel d’agarose et observé le résultat sous UV (Cf. ANNEXE 1, Photo n°1).
Ce processus nous permet donc à la fois d’établir la carte de restriction du plasmide mais également d’isoler le fragment d’intérêt EcoRI / BamHI pour le purifier par la suite.
REMARQUE : L’agarose est le polymère support de l’électrophorèse. La taille des mailles dépend du pourcentage en agarose ainsi à différentes concentrations, le pouvoir résolutif des gels d’agarose varie. En effet, l'augmentation de la concentration d'agarose dans un gel réduit la vitesse de migration et permet la séparation de fragments d'ADN de plus petite taille. Ainsi, la concentration du gel définit le domaine de résolution. Dans ce TP, nous utilisons un gel 1 % m/V.
Afin d’établir la carte de restriction de ce plasmide (Cf. ANNEXE 1, Carte de restriction), nous avons suivi la démarche suivante :
- Construction du graphique : f(Distance de migration) = log(Nombre de paires de bases) grâce au marqueur moléculaire (Cf. ANNEXE 3) ;
→ ZONE DE LINÉARITÉ : Dans cette zone, la distance de migration est proportionnelle au nombre de paires de bases (donc également au poids moléculaire). La résolution du gel utilisé étant de 1 %, le maillage de ce dernier est trop lâche pour les molécules de trop petite taille (points en dessous de la courbe) et, à l’inverse, trop serré pour les molécules de trop grande taille (point en dessus de la courbe). Ainsi, la zone de linéarité se trouve entre des distances de migration allant de 1,4 cm soit 4268 pb à 2,85 cm soit 1584 pb ;
→ ÉQUATION DE LA DROITE :
- Détermination du coefficient directeur : a = avec A(1,58; 3,6) et B(2,2 ; 3,4) donc a - 0,32 ;[pic 1][pic 2]
- Détermination de l’ordonnée à l’origine : ↔ ↔ ↔ b = 4,1[pic 3][pic 4][pic 5]
Donc avec x la distance en cm et y le log(Nombre de paires de bases). Ainsi Nombre de paires de bases = 10y pb.[pic 6]
- Détermination du nombre de fragments d’ADN générés et estimation de leur taille en paires de bases pour chaque digestion (Cf. ANNEXE 1, Tableau) grâce à l’équation de la droite lorsque la distance de migration se situe dans la zone de linéarité.
PROFIL DE RESTRICTION | ANALYSE DU GEL |
P7 / P8 ADN + EcoRI + BamHI | Les profils révèlent deux bandes ayant des distances de migration se trouvant dans la zone de linéarité : la bande la plus haute est à 2,1 cm et la bande la plus basse (insert) est à 2,3 cm. Grâce à l’équation de la droite, nous obtenons respectivement des fragments d’environ2679 pb et 2312 pb. Ainsi, les enzymes de restriction EcoRI et BamHI possède chacune un site de restriction sur le plasmide pUC18-wzc (ANNEXE 4, Schéma 1). De plus, nous pouvons déterminer la taille intégrale de ce dernier : 2679 pb + 2312 pb = 4991 pb.[pic 7] |
P1 ADN |
Le profil révèle une bande unique correspond à de l’ADN circulaire (plasmide) sous forme relâchée. En effet, les deux formes (relâchée et super-enroulée) étant présentes en mélange, la forme super-enroulée est plus rapide car elle prend moins de place et migre donc plus loin. Or, ici, sa distance de migration de 1,2 cm : elle est donc inférieure à celle correspondante à la forme linéaire du profil P2. De plus, cette valeur se trouvant hors de la zone de linéarité de la courbe, nous ne pouvons pas déterminer sa taille précise en pb. |
P2 ADN + Sal I |
La bande unique qui est observée pour ce profil confirme également qu’il s’agit d’ADN circulaire. En effet, l’action de Sal I sur l’ADN a généré un seul fragment à une distance de migration de 1,3 cm, plus élevée que précédemment. Ainsi, la différence de distance de migration des fragments obtenus sur les profils P1 et P2 s’explique par le changement de conformation. En effet, ici, l’ADN se retrouve sous forme linéaire, ayant plus de facilité à migrer à travers le gel que l’ADN circulaire. Sal I possède donc un site de restriction sur ce plasmide et engendre une augmentation de la distance de migration de ce dernier en provoquant sa linéarisation (ANNEXE 4, Schéma 2). Grâce au marqueur moléculaire, nous estimons que cette bande contient entre 5148 et 4268 pb. Cet intervalle ne se trouve pas dans la zone de linéarité, nous ne pouvons donc pas déterminer de valeur précise pour cette bande et donc la taille exacte de l’ADN détecté. Cependant, on note que la taille du plasmide déterminée grâce aux profils P7 / P8 est en accord avec le profil P2 puisqu’elle se trouve dans cet intervalle. |
P3 ADN + Pvu I |
Le profil révèle deux bandes : nous en déduisons donc que Pvu I possède 2 sites de restriction sur ce plasmide (ANNEXE 4, Schéma 3). Ainsi :
|
P4 ADN + Sal I + Pvu I |
Le profil révèle deux bandes :
Sachant que Sal I possède un site de restriction et que Pvu I possède deux sites de restriction sur le plasmide, trois fragments auraient dû être générés par cette double digestion (ANNEXE 4, Schéma 4). Un troisième fragment doit donc exister, expliquant la différence de migration entre les deux bandes les plus hautes des profils P3 et P4, mais n’est pas visible. Ce dernier étant très petit, le BET, agent intercalant, n’a certainement pas pu s’intercaler entre les bases et donc faire briller la bande à l’UV. Nous en déduisons donc que Sal I a son site de restriction proche d’un des deux sites de restriction de Pvu I mais aussi que la taille du petit fragment manquant est de 4169 - 3873 = 296 pb grâce au profil P3. |
P5 ADN + Sal I + Mlu I | Le profil révèle deux bandes :
Sachant que Sal I possède un site de restriction nous en déduisons que Mlu I possède également un site de restriction sur le plasmide proche de celui de Sal I (ANNEXE 4, Schéma 5). |
P6 ADN + Pvu I + Mlu I | Le profil révèle trois bandes (ANNEXE 4, Schéma 6) :
Sachant que Pvu I possède deux sites de restriction nous en déduisons que Mlu I possède un site de restriction sur le plasmide proche de celui de Pvu I (ANNEXE 4, Schéma 6). |
...