Présentation de la méthode PCR

1. Présentation de la méthode PCR

La PCR (Polymerase Chain Reaction) ou Amplification en Chaîne par Polymérase (ACP, ce terme français est très rarement utilisé) par l’ADN polymérase est une méthode d’amplification de gènes découverte par Kary Mullis en 1984.

Les ADN polymérases sont des enzymes qui synthétisent l’ADN de l’extrémité 5’ vers l’extrémité 3’. Les polymérases utilisées en PCR sont extraites de bactéries vivant naturellement à des températures élevées comme les sources hydrothermales du fond des océans. Ces polymérases ne sont pas dénaturées pas la chaleur.

Cette méthode nécessite d’extraire l’acide désoxyribonucléique (ADN) contenu dans différents types de cellules (bactérie, cellule animale, cellule végétale…) selon la recherche réalisée.

1.2.1Bases fondamentales de biologie moléculaire

De manière générale, l’ADN est compacté dans les chromosomes, qui sont eux-mêmes contenus dans le noyau de chaque cellule. L’ADN, transmis lors de la reproduction, contient toute l’information génétique nécessaire au développement et au fonctionnement d’un organisme.

Sa structure standard est une double hélice droite, composée de deux brins complémentaires. Chaque brin d’ADN est constitué d’un enchaînement de nucléotides, eux-mêmes composés de bases azotées (adénine, thymine, guanine et cytosine), d’oses (désoxyriboses) et de groupes phosphate. Les nucléotides se regroupent par paires : adénine avec thymine et guanine avec cytosine, aucune autre paire n’est possible. Les deux brins antiparallèles d’ADN sont toujours reliés entre eux par des liaisons hydrogène (deux entre adénine et thymine, trois entre cytosine et guanine). Les brins sont complémentaires et orientés dans le sens 5’ vers 3’ et assemblés tête-bêche (l’extrémité 5’ de l’un est en contact avec l’extrémité 3’ de l’autre). La taille d’une molécule d’ADN peut varier de mille paires de bases pour la plus petite à plus de six cents milliards (le génome humain en contient environ 3,2 milliards).

La température de fusion de l’ADN (ou de dénaturation) qui correspond à la température pour laquelle 50% des molécules d’ADN sont dénaturées (sous forme simple brin). La connaissance de cette température est un élément important pour la réalisation de la PCR.

 L’information génétique qui constitue le génotype d’un organisme s’exprime pour donner naissance à un phénotype, c’est-à-dire l’ensemble des caractères de cet organisme. Cette expression du génome se fait en plusieurs étapes :

• la transcription, qui est le transfert de l’information génétique de l’ADN vers l’ARN,
• la traduction, qui est un transfert d’information depuis l’ARN vers les protéines,
• et l’activité des protéines.

L’activité des protéines détermine l’activité des cellules, qui vont ensuite déterminer le fonctionnement des organes et de l’organisme.

Il est possible de le résumer ainsi : l’ADN correspond aux lettres qui permettent d’écrire des phrases (ici les gènes) lesquelles écriraient un livre : le génome.

1.2.2Extractions

1. Extraction d’ADN

Les étapes de base de l’extraction d’ADN sont :

• lyse des membranes de la cellule ou du noyau avec un détergent ionique qui désorganise la double couche de phospholipides.
• dissociation des protéines membranaires avec un détergent dénaturant.
• élimination des protéines par un solvant organique déprotéinisant qui dénature les protéines. Il est non miscible à l’eau, de densité supérieure et les acides nucléiques n’y sont pas solubles. Après extraction par agitation, l’ADN se retrouve dans la phase aqueuse supérieure.
• précipitation de l’ADN avec de l’éthanol à 95%.
• lavage du précipité à l’éthanol à 70% pour éliminer les sels puis séchage avant d’être redissous dans un petit volume de tampon.
• élimination des ARN par digestion par une ribonucléase « DNase free ».
• conservation de l’ADN dans un tampon à un pH 7-8 et au froid.

1. Extraction d’ARN

Les étapes de base de l’extraction d’ARN sont :

• homogénéisation des cellules dans un tampon contenant un détergent, un agent dissociant et un agent réducteur.
• centrifugation pour éliminer les débris cellulaires.
• élimination des protéines dans la phase organique inférieure.
• récupération de la phase aqueuse supérieure contenant les ARNs et l’ADN.
• précipitation des ARNs avec de l’éthanol absolu ou de l’isopropanol.
• lavage des ARNs à l’éthanol à 70%.
• conservation dans l’éthanol ou sous forme congelée à -70°C.

1.2.3 La PCR

C’est une technique de réplication ciblée in vitro, qui permet de cloner une séquence nucléotidique en utilisant les propriétés polymérasiques des ADN polymérases thermostables. L’ADN polymérase thermostable initialement purifiée est celle de Thermus aquaticus, bactérie thermophile isolée en 1960 dans les sources d’eaux chaudes du parc de Yellowstone aux Etats-Unis.

Cette méthode permet d’obtenir, à partir d’un échantillon complexe, dégradé, ancien ou en faible quantité, un grand nombre de fragments d’ADN spécifiques et de longueur définie (de l’ordre du million de copies en quelques heures).

1. Principes

La PCR est basée sur la capacité de l’ADN polymérase à synthétiser le brin complémentaire d’un fragment d’ADN simple brin dans la direction 5’→3’ à partir d’un oligonucléotide amorce qui fournit le groupement 3’OH. Il s’agit de réaliser une succession de réaction de réplication d’une matrice double brin d’ADN. Chaque réaction met en œuvre deux amorces oligonucléotidiques dont les extrémités 3’ pointent l’une vers l’autre. Les amorces (ou primers en anglais) définissent alors, en la bornant, la séquence à amplifier. L’astuce consiste à utiliser les produits de chaque étape de synthèse comme matrice pour les étapes suivantes, au lieu de les séparer afin de ne réutiliser que la matrice originale.

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