TP électrophorèse de protéines, électrotransfert et immunorévélation
Dissertation : TP électrophorèse de protéines, électrotransfert et immunorévélation. Recherche parmi 298 000+ dissertationsPar Dorothée Bella • 3 Octobre 2017 • Dissertation • 2 240 Mots (9 Pages) • 1 829 Vues
BELLA dorothee
TP : ELECTROPHORESE DE PROTEINES,
ELECTROTRANSFERT ET IMMUNOREVELATION
BUT
Vérifier la présence du lysozyme dans notre fraction d’élution obtenue dans le TP Lysozyme par une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes, suivie d’une coloration au Rouge Ponceau et une immunorévélation après Western Blot. L’immuno révélation fait partie du western blot donc pour moi c’est illogique de dire “ immunorévélation après un western blot »
PRINCIPES
Electrophorèse en conditions dénaturantes
L’électrophorèse est une méthode d’analyse et de séparation basée sur la migration différentielle de particules chargées sous l’influence d’un champ électrique continu. La migration se fait au sein d’une phase liquide imprégnant un solide poreux ou un gel.
Dans notre cas, la migration a été réalisée avec un gel de polyacrylamide en milieu dénaturant, c’est-à-dire en présence d’un détergent anionique SDS (Sodium DodécylSulfate). Le SDS dénature les protéines en les chargeant négativement, et de ce fait, celle-ci sont séparées uniquement en fonction de leur poids moléculaire.
Le gel de polyacrylamide a un rôle de tamis moléculaire à travers lequel les petites molécules circuleront plus facilement et donc migreront plus loin; les grosses seront plus ou moins retenues par les mailles du gel et donc migreront moins loin. Plus la concentration du gel est élevée, plus les mailles sont petites, et plus les grosses protéines sont retenues.
La révélation des bandes obtenues se fait par un colorant, dans notre cas, le Bleu de Coomassie.
Western Blot
Le western blot est une méthode de biologie moléculaire permettant la détection et l'identification de protéines spécifiques dans un échantillon biologique.
Tout d’abord, on effectue un électro-transfert qui consiste à mettre en contact le gel polyacrylamide de l’électrophorèse, réalisée préalablement, avec un support (membrane de nitrocellulose) imprégné de tampon d’électro-transfert. La face du gel sur laquelle sont déposées les protéines et la membrane sont placées en sandwich entre des papier wattman et des éponges. Le tout est placé à migrer dans une nouvelle cuve soumise à un champ électrique, avec l’anode côté membrane et la cathode côté gel. Les protéines, chargées négativement grâce au SDS, vont alors migrer depuis le gel vers la membrane où elles seront adsorbées.
Puis, on révèle la présence des protéines par une coloration au Rouge Ponceau et une Immunorévélation
Coloration au Rouge Ponceau
La coloration au Rouge Ponceau est une coloration non spécifique et peu sensible. Elle permet la coloration de toutes les protéines présentes.
Immunorévélation
Les protéines sont révélées spécifiquement par l’action d’anticorps dirigés vers la protéine d’intérêt (dans notre cas, c’est action d’anti-lysozymes couplés à la peroxydase). L’anticorps va se fixer de façon spécifique à la protéine d’intérêt et sa révélation se fera par l’ajout d’un substrat qui va réagir avec l’enzyme couplée et former un produit coloré, ce qui identifiera la protéine d’intérêt.
INTERPRETATION
Choix du gel de polyacrylamide :
Deux gels de concentrations en polyacrylamide différentes ont été coulés : 10%(annexe….) et 15%(annexe….) afin de déterminé lequel était le mieux adapté pour la séparation des molécules.
Détermination du pouvoir résolutif du gel de polyacrylamide 15%
distance de migration d (cm) | Masse Moléculaire MM (Da) | Log (MM) | ||
Phosphorylase B | 0,5 | 376 000 | 5,6 | |
Sérum albumine bovine | 1,2 | 67 000 | 4,8 | |
Ovalbumine | 1,8 | 43 000 | 4,6 | |
Anhydride carbonique | 2,7 | 30 000 | 4,4 | |
Inhibiteur de la trypsine | 4,8 | 20 100 | 4,3 | |
α-lactalbumine | 5,6 | 14 400 | 4,2 |
Courbe représentant Log (MM) en fonction de la distance de migration (cm)
[pic 1]
Distance de migration (cm)
On observe qu’il existe une corrélation entre le log (MM) et la distance de migration car la courbe a une portion linéaire qui délimite le pouvoir résolutif du gel de polyacrylamide.
log (MM) | masse moléculaire (Da) |
4,7 | 50 120 |
4,1 | 12 600 |
On peut donc dire que le gel de polyacrylamide de 15% possède un pouvoir résolutif compris entre 12 600 Da et 50 120 Da.
Détermination du pouvoir résolutif du gel de polyacrylamide
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Conclusion
On remarque qu’il y’a beaucoup moins de bandes sur la piste 1 avec ce gel par rapport à celui de 15%. En effet, ce gel étant moins concentré les « mailles » sont plus grandes, par conséquent les protéines peuvent pénétrer plus facilement. La vitesse de migration est donc plus rapide par rapport à la vitesse dans le gel à 15%. Donc, les plus grosses protéines qui présentaient une faible distance de migration dans le gel à 15% ont migré beaucoup plus loin cette fois-ci. Notons également que les petites protéines ont tellement migré qu’elles sont sorties du gel c’est ce que l’on observe pour le lysozyme notamment qui n’apparait que dans le gel à 15%. C’est donc pour cela que nous avons choisi le gel de polyacrylamide 15% car le pouvoir résolutif de ce gel comprend un grand nombre de protéines présentes dans les différents échantillons. De plus, la masse moléculaire du lysozyme étant de 14 000 Da, n’est pas comprises dans la limite d’exclusion du gel.
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