TP enzymologie

Lisa MENETRIER

Emilie MAUFFREY

Purification du lysozyme du blanc d’œuf par chromatographie échangeuse d’ions

But de l’expérience : L’objectif de ce TP est de purifier du lysozyme du blanc d’œuf.

Introduction : Le lysozyme est une protéine globulaire retrouvée dans le blanc d’œuf, impliquée dans la défense contre les infections bactériennes.
La purification de ce lysozyme se fera en une seule étape, par chromatographie échangeuse d’ions.

De façon générale, la chromatographique est une technique consistant à séparer plusieurs constituants d’un mélange et ce, en les faisant migrer. Il existe plusieurs types de chromatographies selon leur principe de séparation.

La chromatographie échangeuse d’ions, utilisée lors de ce TP, peut séparer une large gamme de molécules, allant des acides aminés aux protéines de grande taille.

Ce type de chromatographie permet de séparer les différents constituants selon leur charge nette. Pour cela, on utilise :

• soit des résines chargées positivement, on parle alors de chromatographie échangeuse d’anions
• soit des résines chargées négativement, on parle alors de chromatographie échangeuse de cations

Les échangeurs d’ions sont des macromolécules insolubles qui portent des groupements ionisables. Ils ont la capacité d’échanger certains de leurs ions de façon réversible, et ce au contact d’autres ions qui proviennent d’une solution.

Dans notre cas, afin de purifier le lysozyme, nous utilisons une chromatographie échangeuse de cations. En effet, nous utilisons la carboxyméthylcellulose comme résine d’échange.

Une colonne sera alors composée de cette résine chargée négativement. Cette colonne correspond à la phase stationnaire, et est équilibrée à l’aide d’un tampon à force ionique faible.

L’échantillon brut qui contient les molécules chargées sera utilisé comme phase liquide. Les protéines chargées s’agripperont alors aux groupes fonctionnels à l’opposé chargés dans la résine.

On utilise ensuite un gradient en sel permettant d’éluer les protéines séparées : à des concentrations à faible teneur en sel, les protéines qui ont peu de groupes chargés sont éluées, et inversement.

Enfin, les protéines non désirées et les impuretés seront retenues sur la colonne, elles seront éliminées par lavage

Matériels et méthodes

Résultats :

Discussion :

Vidéo extraction et purification du lysozyme du blanc d’œuf :

La première étape de l’extraction du lyzozyme à partir du blanc d’œuf est d’amenée les protéines contenues dans le blanc d’œuf à un pH égal à 10.  Dans ces conditions, seul le lysozyme est chargé positivement. Les autres protéines du blanc d’œuf sont chargées négativement.

Le blanc d’oeurf est mélangé à 200 mL de tampon A( tampon glycine 25mM dont le pH est égale à 10. Aprè s5 minutes d’agitation, la mélangé est filtré. La solution obtenue après filtration s’appelle le filtrat. On en prélève 20 mL pour effectuer l’extraction du lysozyme. Le filtrat contient toutes les protéines contenues dans le blanc d’œuf.

Il y a ensuite l’étape d’extraction/purification du lysozyme

• Dépôt sur la résine :

On mélange 20 mL de filtrat à une résine de carboxyméthyl-cellulose chargée négativement.  Pour cette expérience, la résine a été conditionnée. Le mélange filtrat + résine est homogénéisée jusqu’à ce que la résine soit en suspension dans tout le filtrat. La réaction entre la résine et le filtrat dure environ 15 minutes sur glace. Au cours de cette réaction, le lysozyme contenu dans le filtrat se fixe à la résine par attraction électrostatique puisqu’il est chargé positivement alors que la résine est négativement. Etant donnée que la résine a sédimentée dans le fond du tube pendant la sédimentation le mélangé est à nouveau homogénéisé. Pour séparer le lysozyme des autres protéines, il suffit de séparer la résine du liquide dans lequel elle baigne. Pour cela, on centrifuge le tube pendant 5 minutes à une vitesse de 1500 g.

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