TP Enzymologie : La lactate deshydrogénase

TP Enzymologie : La lactate deshydrogénase

LDH

L-lactate + NAD ⁺ Pyruvate + NADH + H⁺

Dans ce TP c’est la LDH qui nous intéresse, on va la purifier et l’extraire par chromatographie d’affinité (qui joue sur la spécificité avec des molécules). La chromatographie d’affinité se compose de 2 phases : une phase solide (bille d’agarose) ( Bleu de cibaron proche de NAD⁺ et d’un composant liquide :

Tout d’abord on prépare la colonne, on doit couler une résine en mettant 500 µL de billes d’agarose et 500 µL de tampon. On ouvre la colonne pour évacuer le tampon. Ensuite il y a l’étape d’équilibration où on laisse couler 8mL de lavage.

La charge, on verse 1mL de l’extrait brut (composé de LDH et d’autres molécules). Le LDH va rester bloquer sur la résine et le reste va traverser cette résine, on appelle fraction non retenu ce que l’on récupère a cette étape.

Il y a après une autre étape de lavage (5mL), car à cause d’interactions faible/aspécifique, il se peut que des molécules X se soit fixer sur la résine donc nous allons les enlever.

Fraction de lavage.

On passe après à l’étape d’élution pour détacher la LDH de la résine et la récupérer. On va la décrocher par la méthode de compétition, c'est-à-dire mettre dans la colonne une molécule avec laquelle le LDH aura plus d’affinité. Tampon de lavage + 0,12 mM NADH

On fait 3 élutions de 1mL : -E1 (dans lequel on devrait avoir beaucoup de LDH) -E2 (Où on aura un peu moins de LDH) -E3 (où on aura plus ou presque plus de LDH)

ELECTROPHORESE :

Analyse des 2 électrophorèses :

La 1e a été réalisé dans un milieu dénaturant. (Bleu de coomassie permet de visualiser la teneur en protéines sur le gel)

On va donner à chaque protéine ne charge négative (elles seront toutes chargées pareil négativement). Il reste donc juste leur taille pour pouvoir les séparer. Comme elles sont chargées négativement, elles vont migrer vers le pole positif. Et plus elles seront grandes, moins elles vont migrer.

Dans la fraction de départ (1), on observe plein de bande sur tout le long de l’électrophorèse, chaque bande équivaut à une protéine. Il y a donc plein de protéine dans cette fraction de départ.

Avec l’électrophorèse de la fraction purifié (2), on observe majoritairement 2 bandes (toute monomères), on a donc éliminé des protéines entre (1) et (2). La bande a 35 kDa est le LDH (peu importe le typre elle mesure toujours 35kDa) et la bande a 66 kDa est une protéine contaminante, co-purifié avec LDH. Au moins la moitié des protéines sont des LDH dans (2).

La

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