TP Oxygraphie

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TP : Etude de la chaine respiratoire

BUT

Le but de ce TP est d’étudier le fonctionnement de la chaine respiratoire de mitochondries provenant de foie de rat. Cette étude sera faite à l’aide de la mesure de l’évolution de la concentration d’O2 au cours du temps grâce à un oxygraphe. Dans une première partie, nous étudierons le couplage entre la chaine respiratoire et la phosphorylation, puis dans une seconde partie, nous étudierons l’action de différents effecteurs sur la chaine respiratoire.

PRINCIPES

• Oxygraphe : Il s’agit d’un outil de mesure de l’oxygène présent dans un milieu. L’oxygraphe est composé d’une électrode polarisée : constituée d’une cathode en platine et d’une anode en argent reliées par une solution de KCl conductrice. L’électrode est séparée du milieu par une membrane uniquement perméable à l’oxygène. Les molécules d’oxygène dans le milieu diffusent à travers la membrane puis elles sont réduites par les électrons issus de la cathode. L’argent contenu dans l’anode donne alors ses électrons ce qui produit un courant mesurable et proportionnel à la concentration en O2 du milieu. On enregistre le courant sur un enregistreur réglé sur 1V/div et 1 cm/min.

Pour réaliser l’étude de la chaine respiratoire, nous utilisons des mitochondries provenant de foie de rat, en effet le foie de rat est un tissu riche en mitochondrie et simple à extraire.

• La chaine respiratoire : Elle est localisée dans la membrane interne de la mitochondrie.  Il s’agit d’une chaine de transport d’électron composée de 4 complexes :

• Complexe I : NADH – déshydrogénase
• Complexe II : Succinate – déshydrogénase
• Complexe III : Cytochrome B –c1
• Complexe IV : Cytochrome C oxydase

Les coenzymes réduits (NADH et FADH2) y sont réoxydés, cette réoxydation crée un gradient de protons transmembranaire. Ce qui  permet la synthèse d’ATP par l’ATP Synthase. L’ATP synthase catalyse la réaction de phosphorylation oxydative  soit la réaction : ADP + Pi → ATP 

Voir schéma chaine respiratoire en annexe 1

RESULTATS :

Les courbes que nous avons obtenues lors de notre TP sont inexploitables, car nous ne pouvons pas calculer les pentes, et/ou les changements de pente ne sont pas significatifs. De ce fait, nous avons décidé d’utiliser les courbes données par la professeure.

Efficacité de la chaine respiratoire :

• Tracé 1 :

Après ajout des mitochondries, on observe une pente qui correspond à la consommation d’O2 par les mitochondries, cette consommation se fait grâce aux substrats déjà présents dans la mitochondrie.

- Ajout du Succinate : on observe une augmentation de la consommation d’O2 caractérisée par une augmentation de la pente. Le succinate est le substrat du complexe II de la chaine respiratoire, il est oxydé et transformé dans le cycle de Krebs, réduisant une molécule de FAD en FADH2. La réaction est catalysée par une succinate déshydrogénase : Succinate + FAD → Fumarate + FADH2

- Ajout d’ADP : on observe une augmentation de la consommation d’O2. L’ADP permet d’activer l’ATP synthase, cette synthèse augmente le flux des électrons et des protons. La deuxième injection d’ADP est réalisée après épuisement d l’ADP afin de vérifier que la baisse de consommation d’O2, le retour à une pente nulle, est due à la diminution d’ADP dans le milieu.

Ce tracé nous permet de vérifier que les complexes II, III et IV de la chaine respiratoire ainsi que l’ATP Synthase de  nos mitochondries fonctionnent bien.

RCR : le RCR est le rapport de contrôle de la respiration, il permet de connaître la dépendance de la vitesse de respiration en fonction de la disponibilité de l'ADP. (Le détail des calculs se trouve sur le tableau Annexe 3)

RCR1 = 0.45

RCR2 = 0.36

Le rapport ADP/O : ce rapport nous permet de calculer la quantité d’ADP consommé par molécule d’oxygène. (Le détail des calculs se trouve sur le tableau annexe 4)

ADP/O 1 = 0.66

ADP/O = 1.22

• Tracé 2 :

Cette fois ci nous ajoutons du glutamate-malate : il permet, via la navette malate-aspartate (Voir schéma navette malate-aspartate annexe 2), d’apporter du NADH, H+ qui est le substrat du complexe I. On observe que l’ajout de glutamate-malate permet une augmentation de consommation d’O2.

-Ajout d’ADP : on remarque une augmentation de la pente, qui signifie une augmentation de la consommation d’oxygène. Or la présence d’ADP active l’ATP synthase, il augmente le flux des électrons et des protons, et donc la consommation d’O2 du milieu. La seconde injection d’ADP permet de vérifier que la baisse de consommation d’O2 est due à un manque d’ADP et non un manque de glutamate-malate.

Ce tracé nous permet de vérifier que les complexes I, III et IV de la chaine respiratoire ainsi que l’ATP synthase des mitochondries, fonctionnent.

On calcule les RCR de la même façon que pour le tracé 1, on obtient :

RCR1 = 0.24

RCR2 = 0.23

On calcule le rapport ADP/O de la même façon que pour le tracé 1, soit :

ADP/O = 1.93 (on obtient 2 fois la même valeur de l’ADP/O)

Grâce à ces deux tracés nous pouvons comparer l’efficacité de la chaine respiratoire en fonction du chemin emprunté, en effet dans la chaine respiratoire les électrons peuvent emprunter deux chemins différents : soit le chemin passant par les complexes I -> III -> IV, soit le chemin passant par les complexes : II -> III -> IV. Le tracé 1 nous permet d’étudier le second chemin (passage par le complexe II)  et le tracé 2 le premier chemin (passage par le complexe I).

Afin de comparer les deux tracés, nous allons comparer les rapports ADP/O des tracés, les valeurs d’ADP/O donnent la quantité d’ATP produits par Oxygène réduit, ainsi plus les valeurs sera élevée plus il y aura d’ATP produit pour une même quantité d’oxygène.

La valeur d’ADP/O du tracé 1 (utilisation du complexe II) est inférieure à celle du tracé 2 (utilisation du complexe I). Ainsi le chemin des électrons passant par le complexe I permettrait de produire plus d’ATP, c’est donc le chemin le plus efficace. Cependant pour confirmer notre hypothèse nous allons comparer les RCR. Nous pouvons remarquer que le 1er  RCR du tracé 1 est supérieur au 1er RCR  du tracé 2 et de même pour le 2ème RCR. Cela signifie que l’utilisation du complexe II demande plus d’ADP pour fonctionner à la même vitesse que le chemin passant par le complexe I.

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