TP: Effet de la concentration du substrat sur l’activité enzymatique d’une protéase.

                                                                                                              Date : 20/11/2016

Nom : Djamaa                                                                                                    

Prénom : Soheib

Groupe : 05

Section : A

TP n°02 d’enzymologie  

Titre : Effet de la concentration du substrat sur l’activité enzymatique d’une protéase

But du TP :

La détermination des paramètres cinétiques d’une enzyme protéolytique en utilisant la méthode en deux points : cinétique en un temps fixé.

Introduction :

Les protéines enzymatiques sont des catalyseurs biologiques. Elles présentent une double spécificité : spécificité d'action et de substrat. Les modalités de leur action reposent sur la formation du complexe enzyme-substrat. Les propriétés des enzymes dépendent de leur
structure spatiale. Des modifications de structure spatiale, déterminées soit par des changements de la séquence des acides aminés, soit par des conditions du milieu (pH, température, ions...) et soit par la concentration du substrat, modifient leur activité. Dans notre TP on va jeter les yeux sur l’effet du substrat sur l’activité enzymatique tout en prenant une protéase comme exemple.

Principe :

On mesure la quantité de tyrosine apparue après l’action de la protéase sur la caséine au bout d’un temps fixé car la concentration de tyrosine apparue est proportionnelle aux taux de la protéase présente. On arrête brutalement la réaction au bout du temps fixé par
action de la chaleur, ensuite on mesure la concentration en tyrosine par une méthode analytique convenable et appropriée, c’est le dosage colorimétrique à l’aide du réactif du Folin et Ciocalteau (Il est composé d’un mélange de tungstate de sodium et de molybdate de sodium en solution dans de l’acide phosphorique et de l’acide chlorhydrique. Ce réactif permet la réduction des acides aminés aromatiques (tyrosine et tryptophane) conduisant à la formation d’un complexe coloré bleu foncé dont on mesurera l’absorbance entre 650 et 750 nm) tout en précipitant les molécules non hydrolysés par le TCA.

Matériel et méthode :

On a réalisé la manipulation en deux étapes :

Premièrement, on a préparé deux séries de tubes à essai (4 tubes par essai), dans la première on a préparé le mélange réactionnel tout en mettant dans chaque tube : 500 µl d’extrait enzymatique, 750 µl de tampon phosphate et 1250 µl de substrat (caséine) dont la concentration de caséine diffère de chaque tube à l’autre (0.3% dans le premier, 0.4% dans le deuxième…jusqu’au 0.6% dans le 4éme),ensuite, on a agité et incubé les tubes au bain marie à 50°C pendant 30 minutes. 1250 µl de TCA ont été ajouté dans chaque tube, un petit repos de 10 minutes et on route à la filtration.

Dans la deuxième série les mêmes étapes que la première ont été réalisé avec une petite modification puisque notre but et de préparer des blancs réactif ce n’est pas un mélange réactionnel, Donc, on a éliminé l’étape de l’agitation et l’incubation au bain marie à 50°C pendant 30 minutes.

Deuxième étape (Dosage de l’activité enzymatique) :

On a pris 8 nouveaux tubes à essai et on a les nommé comme les anciens 1, 2, 3, 4, B1, B2, B3, B4, et on a versé dans Chaqu’un : 0.5 ml de filtrat (0.5 ml filtrat de l’ancien tube 1 dans le nouveau tube 1, 2 dans 2, 3 dans 3, jusqu’à B4 dans B4), 1.5 ml de solution de Na2CO3, () et 0.25 ml de réactif du Folin. Agitation et incubation de 30 minutes à température ambiante et vers dosage spectrophotométrique à 750 nm entre blanc et essai pour chaque concentration de caséine (tubes : (1, B1),…, (4, B4)).  

Résultat :

La courbe d’étalonnage du premier TP :

[pic 1]

Par projection on obtient:

[pic 2]

Les paramètres cinétiques de l’enzyme :

D’après le graphe : [pic 3]

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