Compte Rendu d'enzymologie

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SOMMAIRE

1. Introduction générale                                                                            2

1. Objectifs                                                                                               2

1. Principes                                                                                               3

III)1. Spectrophotométrie                                                                                  3

III)2. Chromatographie d’affinité                                                                         3

1. Matériels et méthodes                                                                           4

IV)1. Formation de la chymotrypsine                                                                   4

IV)2. Détermination des paramètres cinétiques                                                     8

IV)3. Etude de l’interaction proflavine/chymotrypsine                                          10

1. Résultats et interprétations                                                                 11

V. 1) Concentration de la chymotrypsine et rendement d’activation du chymotrypsinogene                                                                                         11

V. 2) Activité spécifique de la chymotrypsine                                                      11

V. 3) Paramètres cinétiques de la chymotrypsine                                                 12

V. 4) Interaction proflavine / chymotrypsine                                                       13

VI) Conclusion                                                                                                    15

I) Introduction générale

Le chymotrypsinogène est le précurseur de la chymotrypsine. C’est une enzyme inactive (ou zymogène) présente dans le suc pancréatique.

Le chymotrypsinogène devient actif sous l’action de la trypsine sous forme de chymotrypsine active. Le rôle biologique de la chymotrypsine de catalyser l’hydrolyse des protéines dans l’intestin grêle.

La chymotrypsine est une endoprotéase de spécificité non étroite.

Trois résidus sont essentiels au bon fonctionnement de la chymotrypsine : His 57, Asp 102 et Ser 195 forment la triade catalytique et bordent la poche de spécificité de l’enzyme.

II) Objectifs

Les objectifs de ce TP sont :

• Activer le chymotrypsinogène par la trypsine afin de purifier la chymotrypsine formée
• Étudier l’activité de la chymotrypsine en présence d’un substrat spécifique en présence et en absence d’inhibiteur
• Analyser les interactions du site actif de la chymotrypsine avec la proflavine par spectrophotométrie.

III) Principes

III.1) Spectrophotométrie

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La spectrophotométrie est une méthode d'analyse quantitative qui permet de déterminer l'absorbance d'une substance chimique en solution, c'est-à-dire sa capacité à absorber la lumière qui la traverse.

L'absorbance d'une substance chimique dépend de la nature et de la concentration de cette substance ainsi que de la longueur d'onde à laquelle on l'étudie.

Cette méthode nécessite l’utilisation d’un spectrophotomètre, appareil qui génère une lumière monochromatique de longueur d’onde choisie. Ce faisceau lumineux traverse une cuve (de longueur l, la plupart du temps l = 1 cm) contenant la substance à étudier ; puis la valeur de l’absorbance de la substance étudiée s’affiche sur le spectrophotomètre.

III.2) Chromatographie d’affinité

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La chromatographie d'affinité repose sur l'interaction entre deux ou plusieurs molécules ; elle permet de purifier une substance en séparant les différents composés.
1 - Etape de FIXATION : Le mélange de molécules contenant le composé à purifier est chargé sur la colonne d'affinité. Seule la molécule présentant une affinité pour la colonne sera retenue par l'effecteur greffé sur la phase stationnaire.

2 - Etape de PURIFICATION : En continuant à faire passer du tampon d’élution dans la colonne, toutes les molécules non spécifiques du ligand sont éliminées et éluées.

3 - Etape d'ELUTION : La molécule purifiée est décrochée de la colonne et est recueillie dans l'éluât.

IV) Matériels et méthodes

IV.1) Formation de la chymotrypsine

IV.1) 1) Activation du chymotrypsinogène

Avec cette première manipulation nous devons activer le chymotrypsinogène en chymotrypsine grâce à la trypsine puis étudier son apparition.[pic 8]

Etape 1 : préparation du mélange d’activation en solubilisant 20 mg de chymotrypsinogène dans 2 mL de tampon d’activation.

Etape 2 : on ajoute 10 µL du mélange d’activation dans une cuve contenant 2,7 mL de tampon d’activité et 0,3 mL de substrat Bz-Y-pNA.

Etape 3 : on mesure alors l’absorbance à 410 nm en relevant les valeurs toutes les 15 secondes pendant 2 minutes.

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