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Compte Rendu Clonage Plasmide Pbluescript

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Par   •  4 Mars 2014  •  2 473 Mots (10 Pages)  •  2 985 Vues

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Clonage d’un fragment d’ADN de phage lambda dans un plasmide Pbluescript recombinant

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Groupe 13

Résumer :

Cet article à pour but de montrer comment cloner de l'ADN de phage λ avec comme vecteur un plasmide pbluescript. Nous avons pu voir au cour du TP comment utiliser les techniques de clonage moléculaire via un vecteur, la digestion enzymatique avec les enzyme EcoR1 et Hind III, la transgenèse par choc thermique, l'électrophorèse sur gel d'agarose, et la minipréparation a l'aide du kit d'extraction de plasmide.

Les résultat de cette expérience n'ont pas était très concluant pour ma part du fait de la sensibilité des différent dosage. En effet mes boites de pétri renfermait que 2 à 3 colonies de bactéries de couleur bleu. En revanche, sur l'électrophorèse des fragments de clones amplifiés, on distingue bien la présence du plasmide pour les 4 clones, et 3 différents fragments du phage lambda.

On remarque que cette technique de clonage fonctionne plutôt bien mais dépend particulièrement de la précision des dosages, et des différentes manipulations.

En définitive les multiple technique employé au cour du TP nous permettent de synthétiser une protéine codé par un gêne choisi.

Introduction :

Certaines maladies génétiques prive l'homme de protéines vitales, la mission des biologistes à donc était de trouver comment pouvoir synthétisé des protéines en grande quantité pour pallier au manque de ces malades.

Divers problème se sont présenter à eux comme ; où trouvé une molécule d'ADN capable de se reproduit facilement en grande quantité, comment découper des fragments d’ADN précis, comment lié ces fragment entre eux, puis comment introduire cette ADN recombiné dans une cellule. Ces problème ont était résolu grâce à l'alliance des connaissances en biochimie et biologie.

Le clonage moléculaire est maintenant devenu un outil courants des biologiste. Il est très souvent employer pour synthétisé des protéines nécessaire au patient atteint de maladies comme le diabète insulinodépendant, mais il sert aussi dans le séquençage de génome, et est parfois utiliser dans l'élaboration d'organisme génétiquement modifier. Le clonage moléculaire a subit pas mal de modification depuis sont apparition pour en faire maintenant une technique facile a utilisé et adapté à diverses applications.

Résultats :

Dessin : Électrophorèse du phage λ et du plasmide après digestion enzymatique

La première électrophorèse réaliser après la digestion enzymatique, nous permet de voir l'état des fragments du plasmides et du phages λ . On peut distinguer le plasmide à gauche du marqueur moléculaire, reconnaissable à sont unique bande apparente, et le phage à gauche du plasmides qui possède lui plusieurs bandes apparentes représentant les multiples fragments obtenues après digestion enzymatique.

Dessin : Image de la simulation de l’électrophorèse avec les 11 fragments de phage

Dans le TD In silico on a vue que théoriquement, l’électrophorèse du phage digéré nous donnait 11 fragments de tailles différentes, et que 4 d’entre eux pouvaient être intégré dans le vecteur du fait qu'ils ont tous les 4 était digéré en 5' HindIII et 3' EcoR1

Mes résultats des boites de pétri sont plutôt ridicules, les seul colonies que j'ai réussi à développer sont au nombre de 3, de couleur bleu, et ce sont développer dans la boite de pétri 3 ( bactéries dépourvue d’ADN de phage λ ).

Je n'ai pas de photo car la clarté de l'image était très mauvaise ( portable ) et les résultats n'était ni très visible ni explicite...

Voici ce que j'aurai du obtenir

Dessin : Aperçu d'un clonage de Pbs recombiné réussi.

On voie bien ici les 2 différents types de colonies, les blanches et les bleus.

La présence des 2 colonies montre une transgenèse réussi, mais la différence est que chez les bleus, le clonage a raté contrairement au colonie blanches.

La dernière électrophorèse a pour objectif de voir les différents fragments présent chez les plasmides après amplification des clones obtenus précédemment.

Dessin : Électrophorèse des clones amplifiés après digestion enzymatique

On a ici 4 plasmides différents qui on subit une digestion enzymatique. Un d'entre eux n'est pas recombinant alors que les 3 autres on reçu un des 4 fragments du phage λ compatible au plasmide. On remarque que le 2eme plasmide (en partant de gauche) a recombiné un important fragment d'ADN de phage λ tandis que les plasmides de droite on recombinés des fragments similaires mais de tailles moindres (soit de même tailles soit très proche l'un de l'autre).

Discussion :

Il est maintenant venu le temps de comprendre pourquoi on a eu ces résultats, où ça n'a pas marcher et pour qu'elles raisons.

Pourquoi lors de la première électrophorèse (Dessin:1) nous ne distinguons pas les 11 fragments du phage lambda, et les 2 fragments du plasmide mentionner dans le TD In silico (dessin:2)?

En effet sur le dessin 1 on arrive a distingué quelques fragments mais sûrement pas les 11 qui sont théoriquement réalisable. Ceci est possiblement du a une mauvaise activité enzymatique, ou une trop faible concentration des enzyme de restriction qui n'ont pas réussi a découpé tout leurs sites d'actions. Mais n’oublions pas non plus que certains morceaux étant de tailles semblables, on ne les distingue pas du fait qu'ils ont migré à la même vitesse.

Le plasmide, lui n'a qu'une seul bande visible du fait que l'autre morceau de taille minuscule ( ≈ 12 paires de

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