LaDissertation.com - Dissertations, fiches de lectures, exemples du BAC
Recherche

Rappel TP génétique

Commentaires Composés : Rappel TP génétique. Recherche parmi 297 000+ dissertations

Par   •  16 Novembre 2014  •  2 892 Mots (12 Pages)  •  1 962 Vues

Page 1 sur 12

Introduction

Rappel TP génétique

Objectif du TP : étudier caractéristiques et comportements propriétés de la dsred T3 ???

Principes des techniques

 Chromatographie d’affinité sur colonne de nickel.

La chromatographie d'affinité permet de séparer les constituants d’un mélange et de les purifier. Pour cela on va utiliser l’affinité biologique entre des protéines et un ligand.

 Electrophorèse sur gel de Polyacrylamide et Coloration au Bleu de Coomassie :

Cette technique de laboratoire permet la séparation des protéines grâce à leur différence de masse en présence d’un champ électrique. Les fragments les plus légers migreront plus loin que les fragments lourds. Après la coloration au Bleu de Coomassie, on va comparer la distance de migration de notre protéine et avec celle du mélange des protéines de références qui sont de masse moléculaire connue.

 Western Blot

SPECIFIQUE

Il s’agit d’une électrophorèse en condition dénaturante. La migration se fait selon le poids moléculaire des protéines. On effectue cette fois si un transfert du gel sur une membrane de nitrocellulose (PVDF). La fixation des protéines à la membrane se fait grâce à des interactions hydrophobes et ioniques entre la membrane et les protéines. Grâce à un champ électrique, les protéines migrent de la cathode vers l’anode et passent du gel à la membrane.

Cette membrane est ensuite trempée dans une solution de saturation.

Ensuite, on ajoute une solution d’anticorps anti-protéine. Par la suite, on ajoute un anticorps secondaire anti-espèce couplée à l'enzyme (phosphatase alcaline). La révélation va donc colorer les produits.

Protocole expérimental

Matériels

Pipettes P20 et embouts stériles ​​​​​​ Pipette pasteur

Pipettes P200 et embouts stériles

Pipettes P1000 et embouts stériles

Tubes Eppendorf 200microL

Vortex

Centrifugeuse

Colonne d’affinité ​​​​​​ pipette

Cuve d'électrophorèse ​​​ Vortex​ ​graduée ​Cuve d’électrophorèse

Western Blot : Sandwich Eponge,

Papier wattman,

Membrane de nylon

Induction de la synthèse des protéines par l’IPTG

Dans le cadre de ce TP on a utilisé :

1. Extraction des protéines DsRed T3 et DsRed M

Chaque binôme devait choisir entre la protéine sauvage (DsRedT3) ou ola protéine mutée (DsRedM). Nous avons choisi la mutée sur laquelle nous avons travaillé durant ce TP, et comparée à la protéine sauvage.

La première comparaison observée entre les deux se fut la couleur : en effet la protéine sauvage elle était rouge alors que la protéine mutée était blanche.

Une fois les binômes décidés, nous avons procédé à l’extraction des protéines.

Dans un premier temps, nous avons ajouté 1ml de tampon de lyse (Tris-HCL 50mM PH 8, 1,5 lauryl-sarcosine) dans le tube contenant la protéine mutée pour notre part.

Le tout a été soumis à une agitation brève.

Le mélange, a alors subit trois impulsion de sonication de 10 secondes, avec un intervalle du même temps.

Le tube Ependorf, est alors incubé pendant 15 min à température ambiante (37°)

2. Purification des protéines DsRed T3 et DsRed M

On effectue tout d’abord 2 lavages de la colonne de nickel :

Avec 2 x 1 mL de tampon Tris- HCl 50 mM pH 8

Chromatographie par affinité DsRed M

On prélève et met de côté 50 μL de l’extrait bactérien de DsRed M induit par IPTG : EBM+

On dépose le reste de l’extrait bactérien induit EBM + dans la colonne. La Dsred contient de l’histidine qui va se fixer aux billes de Nickel.

On récupère l’éluât : ce qui n’est pas retenu dans la colonne : Fraction NR

Ensuite on effectue 3 lavages des billes de la colonne :

Avec 3 x 0,5mL de tampon Tris-HCl 50mM pH 8

On récupère des lavages les fractions obtenues dans 3 tubes séparés : L1, L2, L3

Puis on effectue une élution : Avec 6 x 200 μL

de Tampon Tris-HCl 50mM pH8 Imidazole 250mM

On récupère les 6 fractions obtenues dans 6 tubes séparés : E1, E2, E3, E4, E5, E6

On place ces tubes dans la glace.

Maintenant on va placer toutes les fractions obtenues aux UV pour pouvoir comparer leur fluorescence et ainsi vérifier la présence de DsREd. On gardera l’échantillon le plus fluorescent (où la protéine est le plus présente).

3. Electrophorèse

Préparation des gels :

Il faut préparer

...

Télécharger au format  txt (17.1 Kb)   pdf (188.4 Kb)   docx (17.2 Kb)  
Voir 11 pages de plus »
Uniquement disponible sur LaDissertation.com