Localisation D'une Activité Enzymatique Dans Le Foie De Rat

Localisation d’une activité enzymatique dans le foie de rat.

L’objectif de ce TP est localiser l’activité de la déshydrogénase glutamique (GDH) dans le foie de rat. Pour cela, on réalise un fractionnement subcellulaire partiel puis on effectue deux types de dosages pour une analyse à la fois qualitative et quantitative : un dosage protéique par la méthode de Biuret et un dosage enzymatique en point final.

Principe.

Fractionnement subcellulaire:

Cette technique de purification est une séparation des organites intracellulaires par destruction de la membrane plasmique afin d’obtenir un homogénat, puis par désorganisation de la cellule par centrifugation afin d’obtenir des fractions. Elle se déroule donc en deux étapes la deuxième dépendant de la première :

Homogénéisation :

Le but de cette première étape est de casser la membrane plasmique.

Afin de maintenir l’échantillon dans des conditions osmotiques, on met en suspension les cellules dans un tampon pH et de force ionique connus (ici saccharose 0,25M, Tris-HCL 10mM, pH 7,4).

On utilise ensuite un homogénéiseur, ici le potter Elvejhem, qui correspond à un tube en verre muni d’un piston dans lequel on place la préparation. Les cellules sont comprimées, ce qui provoque leur éclatement et donc une libération du contenu cellulaire dans le tampon.

La solution obtenue est un homogénat, une suspension homogène contenant tous les constituants cellulaires dont la plupart des organites sont restés intacts. Une fois l’homogénat obtenu, on peut procéder à la purification :

Purification par centrifugation différentielle :

La centrifugation est une méthode de séparation des particules en fonction de leur densité en les soumettant à un champ de force gravitationnelle élevé.

Ici on utilise la purification par centrifugation différentielle mais il est possible de purifier l’homogénat par centrifugation par gradient.

Les constituants d'un mélange sont séparés en plusieurs étapes :

Par la première centrifugation, on isole les constituants les plus lourds comme les noyaux.

En augmentant au fur et à mesure la vitesse de sédimentation on sépare les constituants de densité croissante.

La centrifugation différentielle sert donc à purifier l’homogénat en fonction de la taille et de la densité de ses constituants.

C’est pour cela que l’on centrifuge l’homogénat à différentes vitesses car par la vitesse de centrifugation, différents organites se retrouvent soit dans le culot, soit dans le surnageant selon leur coefficient de sédimentation.

Homogénat

600g - 10min

Schéma général de fractionnement subcellulaire.

Culot 1 Surnageant 1

Noyaux 10 000g - 10min

Débris cellulaires

Culot 2 Surnageant 2

Mitochondrie 25 000g - 10min

Culot 3 Surnageant 3

Lysosomes 150 000g - 45min

Culot 4 Surnageant 4

Microsomes Cytosol

Membranes plasmiques

Réticulum endoplasmique

Appareil de Golgi

Pour ce TP, nous avons pesé une masse pour le foie de rat de 16,7g que nous avons solubilisé dans 134mL de tampon de saccharose et de Tris-HCL à pH 7,4 correspondant à un tampon « osmotique ».

A partir de l’homogénat on récupère 3 fractions obtenues par deux centrifugations différentes réalisées à 4°C afin d’inhiber les protéases.

L’Homogénat a un volume de 134 mL, on prélève 28 mL pour effectuer les analyses.

De l’Homogénat on met donc à la centrifugeuse 106 mL.

La première centrifugation est celle à 600g pendant 10 min permettant de séparer les éléments les plus massifs par sédimentation dans le Culot 1 d’un volume de 12mL (noyaux et débris cellulaires) que nous ne prenons pas en compte.

Le Surnageant 1 obtenu au cours de cette centrifugation a un volume de 94 mL. On prélève 12 mL pour les analyse et donc remettre à centrifuger 82 mL de S1.

La deuxième centrifugation se fait à 9 000g pendant 10 min permettant de sédimenter les mitochondries dans le Culot 2 que l’on solubilise dans le tampon osmotique pour un volume final de 10,5 mL.

Le Surnageant 2 obtenu a un volume de 76 ml.

Une fois nos fractions prêtes, nous pouvons réaliser nos dosages qui nous permettrons de déterminer la localisation cellulaire de la GDH.

Résultats et Interprétations.

Préparation

On a une masse pour le foie de rat de 16,7 g. Il nous faut 8 mL de tampon/g de tissu initial lors de l’étape d’homogénéisation, c’est pourquoi on a mis 16,7g 8mL/g = 133,6 mL de tampon.

Dosage des protéines par la méthode du biuret

Après l’obtention des 4 fractions cellulaires. On a réalisé une gamme étalon afin de déterminer la concentration protéique dans l’homogénat, les surnageants S1 et S2 et le culot C2.

A partir de cette gamme étalon, nous pourrons en déduire les volumes de ces fractions à utiliser lors des incubations ultérieures.

Ce dosage nous permettra donc de déterminer les quantités protéiques.

On obtient le tableau de résultats suivants :

Nous avons utilisé le tube A correspondant au blanc du réactif pour effectuer le zéro du spectrophotomètre et ainsi négliger

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