Compte rendu de TP

TP métabo du 26.04.16

Intro
Protocole/Manipulation
Matériels et méthodes
Calculs
Discution
Questions
Conclusion

II. Protocole/Manipulation

1) Solutions

• Milieu A : 50 mL de NaCl (50mM) ; Sucrose (3M) ; Tampon phosphate (50mM) à pH7,5

    Préparation de la solution basique AH
Peser dans une coupelle
- 146 mg de Nacl à 50 mM
- 5,13 g de sucrose à 3M
- 355 mg de Na2HPO4 à 50 mM

Les mettre dans un bécher au fur et à mesure, puis complétez à 50 mL avec de l’eau distillée. Puis homogénéiser grâce à un agitateur magnétique et d’un barreau aimanté.

    Préparation de la solution acide AH2

Peser dans une coupelle

 - 146 mg de NaCl à 50 mM

 - 5,13 mg de sucrose à 3 M

 - 345 mg de NaH2PO4 à 50 mM
Les mettre dans un bécher au fur et à mesure, puis complétez à 50 mL avec de l’eau distillée. Puis homogénéiser grâce à un agitateur magnétique et d’un barreau aimanté.

Données : M(NaCl)=58,44 g/mol ; M(sucrose)=342,3 g/mol ; M(Na2HPO4)=141,96 g/mol : M(NaH2PO4)=137,99 g/mol.

Rajouter de la solution acide AH2 5 mL par 5 mL dans la solution basique AH en suivant le pH jusqu’à ce qu’il atteigne 7,5.

• Milieu B : 50 mL de MgCL (5mM)

Prélever 1mL de MgCL2 à 250 mM, les mettre dans un bécher de 50 mL et complétez à 50 mL avec de l’eau distillée.

• Milieu C : 100 mL de NaCl (10 mM) ; MgCl (5 mM) ; HEPES (20 mM) à pH7,5

Peser dans une coupelle

 - 58 mg de NaCl

 - 470 mg de MgCl2

 - 477 mg de HEPES

Données : M (HEPES) = 238,30 g/mol ; M (MgCl2) = 24+ 2*35 = 94 g/mol

1. Préparation des membranes thylakoïde 

Toujours laissez le matériel et les tampon dans de la glace.

  - Peser 10 g de feuilles d’épinard (en prenant le vert et non les tigres) et les mettre dans un bécher en y ajoutant 50 mL de Milieu A. Broyez le mélange et le récupérer dans un bécher.

 - Filtrer le liquide à l’aide d’un gros entonnoir et d’un filtre en nylon et versez tout dans un tube FALCON de 50 mL.

 - Centrifuger le filtrat pendant 5 minutes à 2000 x g

 - Récupérer le tube et vider le surnagent.

 - Ajouter 5 mL de Milieu B
Ce qui nous intéresse et d’extraite les chlorophylles dans les membrane des chloroplastes.

Nous avons un milieu A qui est un milieu hypertonique, très sucré et un milieu B peu riche en sucre.

Lorsque nous mélangeons les 2 solutions, il y a un choc osmotique ou hypertonique : l’eau va entrer dans le membrane et celle-ci vont éclater.

 - Homogénéiser avec un agitateur en verre, jusqu’à ce qu’il n’y ai plus de morceaux. Puis verser dans une autre tube FALCON de 14 mL.

 - Compléter à 14 mL avec du milieu C

Va avoir pour rôle de conserver/maintenir une force ionique autour des cellules, en maintenant un équilibre.

 - Centrifuger pendant 10 minutes à 5000 x g et verser le surnagent

 - Ajouter 3 mL de milieu C et homogénéiser avec de la paraffine puis mettre le tube dans la glace : tube de suspension.

 - Mettre 9,9 mL de mélange acétone/H20 (80% / 20%) et y ajouter 100 µL du tube de suspension : tube d’extraction des pigments.

 - Bien homogénéiser la solution, la filtrer avec un filtre à papier et récupérer le filtrat dans un flacon fourni.

Laisser tout dans la glace sauf le milieu C.

1. Spectrophotomètre

 - Paramétrer le spectrophotomètre à une longueur d’onde = 670 nm. Et commencer à mesurer le blanc en remplissant la cuve de 3 mL de milieu B. Et mesurer l’absorbance d’une cuve contenant 3 mL de Milieu C + 10 µL de notre tube suspension. A = 0,19 mais nous voulons avoir une A = 1 :

0,19 → 10 µL
1      → 52,6 µL

  Ajouter donc 42,6 µL de la solution de suspension dans la cuve.
 Puis reparamétrer le sectrophotomètre pour enregistrer un spectre entre 400 et 700 nm. Refaire le blanc et faire les mesures.

 - Paramétrer le spectrophotomètre à un longueur d’onde = 645 nm. Faire le blanc avec une cuve remplie de 3 mL de mélange acétone/H2O (80% / 20%). Puis mesurer l’absorbance en ajoutant 10 µL de l’extraction.
 Faire la même chose avec une longueur d’onde de 652 nm et de 663 nm.

  Reparamétrer le spectrophotomètre pour enregistrer un spectre entre 400 et 700 nm. Refaire le blanc et commencer les mesures.

1. Mesure de l’activité photosynthétique

 - Prélever 112 µL de la solution de suspension et les mettre dans un bécher de 10 mL, compléter à 10 mL avec de l’eau distillée.

 - Séparer soigneusement cette solution en 5 flacon de 2 mL chacun qui serviront pour l’électrode de Clark.

 - Régler la tension de l’enregistreur à une échelle de 1V/cm et la vitesse de défilement à 2mm/s. Mettre le lampe à proximité de la chambre.

 → Commencer par mettre 2 mL d’eau et quelque poudre de diathonite de sodium. Puis enregistrer.

Cela nous permettra de mesurer le maximum en oxygène et le minimum, qui nous permettra de calculer la quantité initial en oxygène.

 → Vider grâce à une pipette l’intérieur en faisant attention de ne pas percer la membrane. Puis rincer 3 fois avec de l’eau distillée.

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