Colonne Chromatographie

[pic 1]

Colonne Chromatographie

Support → colonne de chromatographie 

Quelle biomolécule peuvent-elles renfermer ? →Polyoside :  agarose / dextran / cellulose et dérivés

Chromatographie liquide à basse pression :

- exclusion moléculaire (filtration sur gel)

- exclusion stérique

- …

CCM = chromatographie sur couches minces

 Quelles biomolécules renferment dans le support ? → Polyoside : dérivé cellulose / acétate de cellulose 

Électrophorèse

Quelles biomolécules renferment dans le support ? → Polyoside : agarose / acétate de cellulose 

Quel support ? → Solide : feuille acétate cellulose 

               →  Gel : agarose

CHROMATOGRAPHIE D’EXCLUSION MOLÉCULAIRE

→ Dextrane (sephadex)

→ Agarose (sepharose, Bio-gel A)

Phase stationnaire = billes poreuses de polysaccharides dextrane (sephadex) agarose (sepharose)[pic 2]

sephadex : « separation pharmacia dextran »

sepharose : « separation pharmacia agarose »

→ Au cours de l’élution par le tampon les macromolécules sont

séparées suivant leur tailles, (formes) : molécules les plus                                                      volumineuses éluées en premier = non retenues dans le gel.

[pic 3][pic 4]

SEPHADEX (pharmacia)

Microbilles poreuses de dextrane (polymère de glucose) réticulées à l’épichlorohydrine

Dextrane = polymère d’ α-D-GLC (1-6) unités isomaltose = α-D-GLC(1-6)GLC + qlq ramifications α(1-3) ou α(1-4)

Différentes variantes (G-25, G-200) selon le degré de réticulation : différentes de capacités de rétention d’eau ( 50 à 98%), porosités, domaines de fractionnement, limites d’exclusions, etc..

G10-G50 : pores plus petits, (plus d’agent réticulant) → domaine de fractionnement très réduit,                débit rapide, et limite d’exclusion très basse, ex : limite exclusion G-25 = 5000Da (dessalage)

[pic 5]

G-200 : Pore plus gros (moins d’agent réticulant) → Domaine de fractionnements plus élevé

Ex : limite de résolution G-200 = 600 000 Da

→ + pores les sont gros + Numéro du G est grands

ex : production du lait sans lactose (personnes intolérantes)

par dessalage du lait = utilisation de colonne de tailles

 industrielles)

G : quantité d’eau retenue quand les billes gonflent (et se remplissent d’eau) en ml d’eau par g de sel sec.

[pic 6]

SEPHAROSE = (pharmacia), bio gel A, de (bio-rad)

→ Microbilles d’agarose gélifié et débarrassé de ses contaminants chargés.

Chaque chaines d’agarose a une masse molaire d’environ 120 000 Da

Polymère d’un diholoside = D-GAL et 3,6anhydro-L-GAL liés en β-(1-4)

Stabilité due aux liens hydrogènes qui lient les polymères d’agarose entre eux.

Domaine de fractionnement variable selon la quantité d’agarose

Limites d’exclusion extrêmement élevées (de l’ordre du million de Da)

Agarose

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Différents types selon la concentration en agarose : différentes gammes de fractionnement

[pic 9]

Structure en double hélices (molécules d’eau peuvent entrer dans la cavité centrale) :

formation de gels contenant jusqu'à 99,5 % d’eau

Il existe : du SEPHAROSE et du SEPHAROSE CL 

sepharose CL = (pharmacia) = agarose réticulé à l’épichlorohydrine (porosité identique au sepharose, mais plus résistant = résistance thermique et chimique)

Agarose = polymère de D-GAL et 3,6anhydro-L-GAL liés en β -(1-4)

[pic 10]

Intérêt mol rétituclé =

→ on peut appliquer des débit plus élevé avec le réticulé que sans le réticulé = gain de temps de séparation

CHROMATOGRAPHIE D’AFFINITÉ

→ Agarose

→ Cellulose

...