CR TP Filtration

CR TP filtration

But : On cherche à éliminer rapidement un agent réducteur (dithiothréitol) d’une solution protéique par la méthode de centrifugation-élution de Penefsky.

Principes :

• Filtration sur gel : Appelée également chromatographie d’exclusion stérique, c’est une technique préparative et analytique qui permet de séparer des molécules selon leur taille et leur forme. Cette chromatographie de partition repose sur 2 phases : une phase stationnaire composée de billes poreuses d’un polymère insoluble très hydraté (dextrane) et une phase mobile aqueuse contenant les composés à séparer.

Les plus grosses molécules sont exclues du gel et sont donc éluées en premières tandis que les plus petites sont incluses dans les pores du gel et sont donc éluées en dernières. Donc plus les molécules sont petites, plus elles diffusent lentement.

[pic 1]

Schéma du principe de séparation des molécules par filtration sur gel

Il existe une limite d’exclusion définie par la masse moléculaire de la plus petite molécule incapable de pénétrer dans les pores du gel. Au-delà de cette valeur, les molécules sont exclues.

Le domaine de fractionnement du gel défini l’intervalle de masse moléculaire MM que ce gel est capable de séparer. Dans ce domaine, log MM est proportionnel au volume d’élution.

• Méthode de Penefsky : C’est une chromatographie d’exclusion stérique qui repose sur 2 centrifugations. Une première servant à éliminer l’excès de tampon, puis une seconde pour filtrer la solution et ainsi récupérer le filtrat. L’avantage de cette méthode est sa rapidité de filtration, notamment grâce à l’utilisation d’un rotor à godets oscillants.

• Méthode de Lowry : C’est une méthode de dosage colorimétrique des protéines qui repose sur la coloration bleue de certains acides aminés aromatiques tels que la tyrosine et le tryptophane. Pour cela, on effectue un prétraitement cupro-alcalin (réactif de Gornall) qui complexe les ions cuivres avec les liaisons peptidiques de la protéine : coloration violette. Le réactif de Folin-Ciocalteu (jaune) ajouté est réduit par le complexe protéine-cuivre : couleur bleue (développée après 30 mn d’incubation à l’obscurité). L’intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration protéique. On peut donc déterminer la concentration en mesurant l’absorbance (à 750 nm).

Cette méthode est plus sensible que la celle du Biuret, mais de nombreuses substances non protéiques peuvent interférer dans le dosage. Pour y pallier, les protéines sont précipitées à l’acide trichloroacétique et le culot est repris dans de la soude.

• Dosage spectrophotométrique : voir tp enzymo

+ gamme étalon

Résultats :

• Manipulations effectuées :

- Solution de BSA : On désire faire une solution standard de BSA à 1 mg/mL. On veut en préparer 20 mL. Pour cela, on pèse 20 mg de BSA dans un bécher. On verse le contenu dans une fiole jaugée de 20 mL. Avec une pissette d’eau distillée, on rince correctement les bords du bécher en évacuant l’eau dans la fiole afin de ne pas perdre de BSA. On complète la fiole jaugée avec l’eau distillée jusqu’au trait de jauge. On agite. On n’a pas besoin d’autant de solution de BSA mais le côté pratique de la manipulation nous impose un volume minimum de 20 mL puisque nous ne disposons pas de fiole jaugée (matériel précis) plus petite.

- Soude diluée : On dispose d’une solution de soude à 5M. On veut en préparer 0,5 mL à 0,2M. Soit CiVi = CfVf d’où Vi= CfVf/Ci= 0,2*0,5.10-3/5= 20 µL. On prélève donc 20 µL de soude 5M que nous complétons avec 480 µL d’eau distillée dans un tube. On agite.

- NA2CO3 2% dans NaOH O,1M : On dispose de soude 5M et de NA2CO3 en poudre (solide). On désire 25 mL de solution. Soit CiVi = CfVf d’où Vi= CfVf/Ci= 0,1*25.10-3/5= 500 µL. On prélève donc 500 µL de soude 5M que nous complétons avec 24,5 mL d’eau distillée dans un bécher. On agite.

Comme on désire du  NA2CO3 à 2% soit 2g pour 1OO mL de NaOH 0,1M, on pèse 500 mg de NA2CO3 que l’on ajoute aux 25 mL de NAOH 0,1M préparés. On agite le tout.

- Réactif de Folin-Ciocalteu : on désire préparer 12 tubes (7 pour la gamme étalon + 1 blanc + 2 prises d’essai de la solution de départ + 2 prises d’essai du filtrat). On doit ajouter 100 µL du réactif dilué de moitié dans chaque tube. On prépare donc 1,5 mL (1,2 mL nécessaires et un peu plus au cas où). Pour cela, on prélève 750 µL du réactif que l’on complète avec 750 µL d’eau distillée dans un tube.

- Dosage du DTT par le DTNB : Dans une cuve, on ajoute 300 µL de DTNB que l’on complète avec 2,7 mL de tris-HCl.

• Calcul de la concentration exacte de la solution standard de BSA :

On mesure l’absorbance de la solution standard de BSA à des concentrations croissantes. Pour cela, nous effectuons des mesures à des volumes croissants de solution standard de BSA pour un volume final dans la cuve de 3 mL. On obtient le tableau suivant :

Tableau brouillon

On trace la courbe Absorbance corrigée = f(volume de la prise d’essai). Voir figure1 en annexe. On obtient une droite passant par l’origine donc l’absorbance est proportionnelle au volume de la prise d’essai et donc de la concentration de la solution standard de BSA selon la loi de Beer-Lambert.

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