TP HPLC

                                                                                                        18/10/2017

Compte-rendu TP Biochimie structurale et fonctionnelle : HPLC

1. But

L’objectif de ce TP est de trouver la localisation du site d’interaction d’un peptide synthétique avec l’héparine, un glycosaminoglycane naturel, grâce aux techniques de chromatographie inversée et de HPLC.

1. Principe

• La Chromatographie Liquide à Haute Pression (HPLC)

C’est une technique d’une grande sensibilité permettant une meilleure résolution et des résultats fins et plus précis par rapport à d’autres techniques chromatographiques comme la chromatographie sur couche mince. Elle consiste au partage de molécules entre une phase stationnaire et une phase mobile sous l’effet d’une forte pression.

La phase stationnaire est une matrice incompressible sous forme de billes ou de micro-particules poreuses homogènes, comportant une certaine granulométrie. 

La phase mobile est une solution de protéines que l’on veut étudier.

L’HPLC consiste à exercer une pression à l’intérieur d’un système afin de pousser la phase mobile à travers une colonne contenant la phase stationnaire incompressible.

Cependant, selon la nature de la phase stationnaire, il est possible d’avoir d’autres critères de séparation en jeu : selon la polarité, l’affinité, etc.

Le système est composé de plusieurs parties :

• Une pompe : elle va contenir la phase mobile (solvants) et va fournir la pression
• Un dégazeur pour ne pas endommager l’appareillage
• Une vanne d’injection : elle va nous permettre d’injecter notre échantillon de solution de protéine à étudier
• Une colonne : contenant la phase stationnaire, et à travers laquelle on va faire passer la phase mobile
• Un détecteur, enregistrant l’ordre des molécules sortantes
• Un ordinateur traduisant par chromatogramme

• La chromatographie en phase inversée avec appariement d’ions

C’est une chromatographie liquide de partage, c’est-à-dire que la séparation des molécules va se faire selon leur polarité. Contrairement à la chromatographie en phase normale, la chromatographie en phase inversée comporte une phase stationnaire apolaire et la phase mobile doit être polaire. Donc plus une molécule est apolaire, plus elle va pouvoir interagir avec la phase stationnaire apolaire et sera donc retenue plus longtemps. Inversement, une molécule polaire ne va pas interagir avec la phase stationnaire, elle ne sera donc pas retenue et la molécule sortira très rapidement de la colonne.

L’appariement d’ions se fait à l’aide de l’acide trifluoroacétique (TFA). C’est un acide fort CF3COOH légèrement hydrophobe et présentant des atomes de fluor dans sa structure, lui conférant une charge négative. Cette propriété va lui permettre de se fixer sur des molécules basiques chargée positivement, et ainsi éliminer l’effet ionique pouvant être présent au niveau de l’interaction des molécules entre elles, pour optimiser la séparation selon la polarité.

Afin d’obtenir des résultats exploitables, il est important de filtrer chacun des solvants utilisés, avec une filtration à deux niveaux, avant leur mise en bouteille, puis avant leur passage dans l’appareil grâce à des filtres directement installés avec leur tuyaux dans les bouteilles (schématisé précédemment sur le schéma de l’appareil d’HPLC. Le dégazage des solvants avant qu’il n’entre dans la colonne est également une étape cruciale pour ne pas endommager l’appareillage.

1. Résultats et interprétations

Lors de notre TP, nous avons utilisés plusieurs paramètres nécessaires pour obtenir des résultats cohérents et interprétables. Nous avons utilisé comme matériel une colonne (3cm x 2,1 mm) avec une phase stationnaire apolaire en silice greffée (Greffage C8), avec une porosité de 300 angström et d’une granulométrie de 7 microns. Le débit, permettant de pousser la phase mobile à travers la colonne est d’une valeur constante de 1 mL/min et est assuré par la pompe. Afin d’obtenir une bonne séparation des composés, on utilise deux solvants (préalablement dégazés et filtrés à deux niveaux, avant leur mise en bouteille puis avant qu’ils entrent dans le système) : A (TFA 0.1% dans de l’eau) et B (acétonitrile 90%, TFA 0.1%). Ces solvants sont soumis à un gradient linéaire d’acétonitrile avec de l’acide trifluoroacétique (TFA) 0.1%. Le programme est le suivant : aux conditions initiales, on a 95% de A et 5% de B permettant l’étape de fixation des molécules apolaires sur la phase stationnaire, le solvant A étant polaire tout comme la phase mobile. Après 12 minutes, on procède à l’étape de séparation en réglant le gradient à 70% de A et 30% de B, l’acétonitrile étant un composé plutôt apolaire, il va pouvoir permettre l’élution des composés apolaires liés à la phase stationnaire lors de l’élution. Enfin, la dernière phase consiste à revenir aux conditions initiales pour recommencer une élution suivante avec A : 95% et B : 5%.
Nous utilisons la longueur d’onde de 214 nm pour suivre l’élution des peptides car cette longueur d’onde permet de tout absorber avec un détecteur de diode. L’élution est indispensable afin d’obtenir des résultats. En effet, lors de la vente pour le gel d’héparine, les industriels ajoutent des conservateurs pour inhiber les bactéries, or ils absorbent à 240 nm, ce qui masquerait l’absorbance de notre peptide. C’est pour cela que nous réalisons une élution.

L’analyse de notre peptide étant de nature qualitative et non quantitative, le volume lors de l’injection n’est pas précis, il est d’environ 150 μL mais le plus important est de veiller à la précision des manipulations et de l’injection, notamment à ce qu’il n’y ai pas de bulles injectées dans l’appareillage (hormis autour du piston lors du prélèvement par seringue).

Nous avons utilisé comme enzyme pour l’hydrolyse du peptide, l’α-chymotrypsine. C’est une endoprotéase, ce qui signifie qu’elle va hydrolyser les liaisons peptidiques entre les acides aminés. Cependant, cette enzyme coupe préférentiellement la liaison peptidique en aval des acides aminés aromatiques, on parle de la tyrosine (Y) qui est polaire, du Tryptophane (W) et du Phénylalanine (F) qui sont apolaires. On va ainsi obtenir des sous-peptides qui seront analysés par HPLC selon l’affinité avec l’héparine. On pourra ensuite identifier celui contenant le site d'interaction via son temps de rétention.

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