Site internet d'introduction aux techniques utilisées en biochimie

Mise à jour:

16 juin 09 Site internet d'introduction aux techniques utilisées en biochimie

DIALYSE

Il se produit souvent qu'une préparation de macromolécules contienne différents produits dont on veut se débarrasser. Ces produits, sels, glucides, détergents ou autres petites molécules, étaient présents dans la préparation initiale ou ont été introduits lors d'une étape de la purification. Une façon simple d'éliminer ces petites molécules est la dialyse. Les molécules de petite taille qui traversent la membrane du sac à dialyse sont qualifiées de diffusibles. Celles qui sont trop grosses sont dites non-diffusibles.

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PRINCIPES DE BASE

La dialyse est basée sur les principes régissant la diffusion à travers une membrane perméable ou semi-perméable. Deux mécanismes entrent en jeu dans ce processus. Tout d'abord, les molécules diffusibles vont traverser la membrane selon le gradient de concentration. Il y aura donc un déplacement net des molécules du coté le plus concentré vers le coté le moins concentré. Chaque espèce chimique en solution, si elle est suffisamment petite, subit individuellement ce processus. À l'équilibre, les concentrations de chaque espéce diffusible seront égales de part et d'autre. Si le volume du liquide à l'extérieur du boudin est très grand par rapport à celui de la solution à dialyser, cette égalité des concentrations implique que la majorité des molécules diffusibles, en terme de quantité (poids), est en fait sortie de la solution contenue à l'intérieur de la membrane à dialyse. On peut amplifier cette élimination des molécules diffusibles en répétant ce processus. Ce processus est également accéléré par brassage du montage.

L'autre mécanisme implique les charges électriques des molécules. En effet, le gradient électrique joue aussi un rôle. Ce gradient électrique résulte de l'ensemble des espèces chargées de part et d'autre de la membrane. L'équation de Nerst décrit ce phénomène. Ce dernier facteur est cependant négligeable dans la dialyse et, en pratique, on ne tient compte que du gradient de concentration.

Un autre phénomène se produisant de façon concommitante avec le mouvement des petites molécules est l'osmose. En effet puisque le contenu du sac à dialyse, au début du processus, est souvent plus concentré que le liquide de contre-dialyse, l'eau, par osmose, entrera dans le sac. Cependant, au fur et à mesure que les particules diffuseront hors du sac, la concentration de part et d'autre de la membrane s'équilibrera et l'osmose ne sera plus un facteur dans les concentrations à l'intérieur ou à l'extérieur du sac. De toute évidence, l'entrée d'eau dans le sac durant la dialyse fera augmenter le volume de lqiuide dans le sac. On doit donc tenir en compte cette possibilité en laissant un espace vide dans le sac lorsqu'on y met le liquide à dialyser.

La vitesse de la dialyse, c'est-à-dire le moment où l'équilibre est atteint est affectée par les facteurs qui modifient la mobilité des composantes dialysables. Les non-dialysables, puisqu'elles ne diffusent pas, n'atteignent évidemment jamais l'équilibre. La température, augmentant le mouvement des particules, accélèrent la dialyse mais de façon relativement limités. De plus la plupart des molécules biologiques sont instables à plus fortes températures et on procède généralement à 4°C. Le rapport entre le volume contenu dans le sac à dialyse et la surface de la membrane est aussi important. En effet, plus ce raport est faible, plus il y aura de pores par lesquelles les molécules diffusibles pourront sortir du sac

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MÉTHODOLOGIE ET APPAREILLAGE

Il existe plusieurs matériaux employés pour fabriquer des membranes à dialyse, les plus communéments employés sont les esters de cellulose ou d'autres dérivés cellulosiques. On peut obtenir des membranes ayant des niveaux de porosités ("cutoff") divers mais faciles à controler lors du processus de fabrication, de 100 à un million de Da (en termes de taille de protéines)

Les plus employés sont faits de cellulose "régénérée", c'est-à-dire récupérérée de "bourre de cotton" ("linters"), des fractions de cotons inutilisables pour faire du tissu, puis purifiée. Ces membranes sont faciles d'emploi, flexibles, résistantes et économiques. Leurs désavantage sont d'être hydrophyles, ce qui est contre-indiqué pour certaines applications très spécialisées, et la gamme des porosités possibles est plus limitée. Certains fabiquants ont mis au point des systèmes de microdialyse pour traiter des volumes aussi petits que 250 µL

On place la solution à dialyser dans un tube fait d'un membrane semi-perméable, souvent de la cellulose ou un dérivé. On referme les deux bout de ce tube, formant ainsi un "boudin" en prenant soin de garder un certain espace vide pour accomoder l'eau qui pourrait y entrer par osmose et qui risquerait de faire éclater le sac si elle n'a pas d'espace. On place ce boudin dans la solution contre laquelle on veut faire la dialyse (liquide de contre-dialyse).

Les membranes poreuses des tubes sont fait de matériel polymérisé obtenu par un processus industriel. Ce processus laisse des résidus, souvents des métaux lourds et du sulfure, en plus des produits préservatifs anti-bactérien (azide de sodium, etc.) qu'il faut éliminer. Généralement un chauffage dans une solution de triphosphate de sodium et d'EDTA est suffisant.

Les membranes à dialyse sont caractérisées par une limite d'exclusion ("cut-off") qui sert à donner une idée de la taille des molécules qui ne pourront pas la traverser (de masse supérieure à la limite) et de celles qui pourront diffuser (de masse inférieure à la limite). La plupart des membranes disponibles dans le commerce ont généralement une limite de l'ordre de 5-15 kDa. Il faut comprendre que cette valeur est approximative car la taille ne varie par linéairement avec la masse, la géométrie

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