Génie Microbiologique : Production de Lipopeptide par culture de Pseudomonas syringae en bioréacteur :

Génie Microbiologique : Production de Lipopeptide par culture de Pseudomonas syringae en bioréacteur :

Introduction :

        Les bactéries Pseudomonas syringae sont des bactéries Gram – en bâtonnets produisant un large spectre de lipopeptides par voie non ribosomique (NRPS) appartenant à deux différents groupes [1]:

• Le groupe des Non-apeptides : syringomycines, syringostatines, syringotoxines ;
• Le groupe des syringopeptines.

Cette bactérie possède 3 propriétés importantes : un pouvoir pathogène, un pouvoir glaçogène et une aptitude à la vie épiphyte. [2]. Cette troisième propriété est traduite par une forte capacité à coloniser la surface des organes aériens des plantes, à s’y multiplier de façon importante. Une production de lipopeptide antifungique par ces bactéries offre donc de nombreuses applications, dont les biopesticides. Ce protocole a pour objectif de cultiver une souche de Pseudomonas syringae en bioréacteur en vue d’en extraire et purifier les lipopeptides produits. Nous évoquerons aussi le genre Bacillus qui a aussi un potentiel dans la production de biosurfactants.

Matériel et Méthode [3]:

Milieu de culture :

• Les bactéries seront cultivées dans un milieu King B, à pH 7.2 et à température de 25°C. Ces critères correspondants aux critères optimaux pour la production de lipopeptide par Pseudomonas.
• On utilisera un milieu Landy pH 7 à 30°C pour Bacillus.

Bioréacteur :

        Le bioréacteur utilisé est un bioréacteur à disque, qui est un cylindre de 40 cm de longueur et 10 cm de diamètre. Il sera préalablement stérilisé par autoclave pendant 30 min à 110°C. Ce type de bioréacteur permet une homogénéité du milieu de culture, car les disques et les agitateurs sont en rotation. L’aération se fait par les interfaces gaz-liquide, cela permet l’apport en oxygène nécessaire à la production de lipopeptides tout en évitant la formation de mousse. Les disques en aciers assurent l’adhésion des cellules et la formation de biofilm. On réalisera pour Bacillus et Pseudomonas une culture en batch pendant 72h.

Dosage et extraction des lipopeptides :  

Le dosage des lipopeptides nécessite la préparation d’échantillons, il se fera par chromatographie liquide haute performance en phase inverse (CLHP), la colonne utilisée est une C18 conditionnée par 20 mL de méthanol 100% puis rincé avec 10 mL d’eau ultra pure.

On utilisera un filtre de cellulose 0,22 µm dans lequel sera passé le surnageant de culture. Il faudra donc passer à la centrifugeuse (10000 rpm pendant 5 min). On injectera 20µL de cet échantillon récupéré à l’HPLC.

L’extraction des lipopeptides est faite via la méthode de pertraction, grâce à l’utilisation d’un contacteur à disque tournant. La rotation des disques permet la formation de films aqueux sur les surfaces hydrophiles des disques.

Ces disques en contact direct avec la phase d’alimentation (F) (surnageant de culture dilué et tamponné à pH 5,7 avec une solution de phosphate de potassium (0.2 mol.L-1 de phosphate)) permettent le transfert des molécules extractables. Les volumes des phases aqueuses seront de 270 mL chacune. La phase réceptrice (R) est une solution aqueuse à 0.2 mol.L-1 de tampon phosphate à pH 7,3. La membrane liquide (M), on utilisera 1250 mL de n-heptane. L’extraction des lipopeptides semble très dépendante du pH. [pic 1]

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