Stage Biotechnologie Expression D'une Protéine Virale

Intro scientifique (2 pages)

Epissage : régulation qualitative l'expression des gènes. (95% genes sont épissés alternativement) (ref).

Epissage--> maladie (cancer) (ref)

Epissage--> oncovirus (ref)

(faire un schema sur page en face)

Dans le laboratoire l’équipe cherche comprendre leucémogenèse (l'apparition cancer) en utilisant un agent carcinogène biologique): HTLV-1. HTLV-1 (Human T-cell leukemia virus type 1), responsable de La leucémie aiguë à cellules T de l'Adulte (ATL) est le premier rétrovirus oncogène humain identifié (ref). Il est également responsable de maladie inflamatoire, dont la paraparaisie spastique tropicale (TSP/HAM) qui est la plus importante en terme d'incidence (ref). Alors que HTLV-1 infecte principalement les CD4+ et CD8+, l'ATL est uniquement de phénotype CD4+. (il y a seleuent 5% des personnes infectés par HTLV-1 qui déclare la maladie) (ref). Les zones endémiques (japon, caraibe, amérique latine). Voies sexuelle, allaitement, seringue. Pas de traitement actuellement (espérance vie 1 an).

Infection --> du a une dérégulation des gènes cellulaire (expansion clonal / maladies) Tax et HBZ sur la régulation des promoteurs cellulaire impliqués dans (mort cellulaire, prolifération, immunité) (ref). Dans le labo, évidence, HTLV-1 infection --> dérégulation de alternative splicing des gènes cellulaires (pas encore publié) (étude Cellules issus patients infectés naturellement par HTLV-1 ne présentant pas de maladie (phase préleucémique) ATL (pas fait). Mécanisme ?????? (Rôle Tax sur épissage (gènes cellulaire / minigènes). tax promoteur dépendant ou pas ?

Intro technique (objectifs du stage)

tax à un effet dépendant du promoteur ?

Effet de tax sur même minigène avec diffétent promoteurs

Culture cellulaire

transfections (minigène dans Cellules exprimant tax)

extraction ARN / protèine

RT-PCR (tax/actin/minigène) + gel + photo

WB (tax)

Effet de tax sur différents minigène avec le même promoteur

Clonage minigène

+ paragraphe avant

Développement du WB

Résultats

Conclusion/perspectives

Sommaire :

Introduction

But :

I. Matériel et méthode

A. Transfection

On appelle transfection le processus de transfert de gènes, c'est-à-dire l'introduction d'ADN étranger dans des cellules eucaryotes. Le terme « transfection » est assez analogue au processus de transformation bactérien, mais ce terme n'a pas été appliqué aux cellules animales, du fait de son association à un stade pré-cancéreux. Elle est typiquement réalisée par l'ouverture transitoire de « trous » dans les cellules pour permettre l'entrée de molécules extracellulaires, comme un plasmide d'ADN superenroulé, ou d'autres.Les cellules manipulées pour accepter un ADN étranger sont appelées « cellules compétentes ».La technique la plus classique et la moins chère, est la transfection par phosphate de calcium, découverte par S. Bacchetti et F. L. Graham en 1977. Une solution saline tamponnée par HBS doublement concentrée et contenant des ions phosphate est combinée avec une solution de chlorure de calcium contenant l'ADN à transfecter. Lorsque ces deux solutions sont combinées, il se forme un fin précipité de phosphate de calcium, liant l'ADN à transfecter à sa surface. La suspension contenant le précipité est alors ajoutée aux cellules à transfecter (habituellement une culture cellulaire monocouche). Par un procédé non entièrement compris, les cellules incorporent le précipité contenant l'ADN (les ions Ca2+ se fixe sur l’ADN qui a une polarité négative lui permettant d'entrer dans la cellule).cette transfection se fait essentiellement sur de cellules adhérente c’est-à-dire qu’elle se fixe sur le fond de la boite.

12h avant d’effectuer une transfection la culture doit être d’environ 350 000 cellules dans des puits de 2 mL. À partir de cellules en culture, il faut réaliser un dénombrement pour ensuite planter dans chaque puits le nombre de cellules souhaité en réalisant une dilution.

12h après Pour transfecter des cellules il faut qu’elle soit à 50% de confluence c’est-à-dire que la culture cellulaire soit étendue sur la moitié de la boite et que ces cellules sont bien fixées sur la boite. Renouveler le milieu 1heure avant la transfection est essentiel afin que les cellules soit dans des conditions optimales. Des mix sont préparer pour transfecter avec de l’ADN étranger que l’on veut introduire dans la cellule, des ions Ca2+ et des phosphates contenu dans le tampon HBS 2X. 1h après les mix sont déposés sur les cellules indirectement pour éviter de les détacher de la boite et ils sont mis à incubation 5h à 37°C le produit de transfection qui est lourd peut tomber sur les cellules et s’insérer dans les cellules mais ce milieu devient toxique pour ces dernière au bout d’un certain temps donc il faut renouveler le milieu. 48h après on peut les récupérer pour faire des culots cellulaire sec afin d’extraire l’ARN et les protéine des cellules

B. Extraction protéine et ARN

1. Extraction ARN

Extraction D’ARN signifie séparer l’ARN des autres composant de la cellules envue de réaliser une RT PCR. Au laboratoire on utilise la méthode au phénol chloroforme (voir le protocole en annexe) cette méthode permet d’avoir de l’ARN purifier à 95% et cette méthode et peu couteuse seuleument elle est dangeureuse car elle utilise du chloroforme qui en présence d'oxygène et sous l'action de la lumière, a tendance à se décomposer en donnant du chlorure d'hydrogène, du chlore et de l'oxychlorure

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