Le fonctionnement de la Chaîne Respiratoire

But :

Le but de ce TP est d’étudier le fonctionnement de la chaîne respiratoire et de spécifier le lieu d’action de certains inhibiteurs, en mesurant la consommation d’oxygène par les mitochondries hépatiques du rat au cours du temps grâce à un oxygraphe.

Principe :

La chaine respiratoire :

La chaîne respiratoire correspond à une association de complexes protéiques présents au sein de la membrane interne de la mitochondrie et responsable, avec l’ATP synthétase, de la phosphorylation oxydative. Ce processus associe l’oxydation du NADH et du FADH2, tous deux produits lors des différentes voies cataboliques de l’organisme (glycolyse, cycle de Krebs, hélice de Lynen…), à la production d’ATP et ceci grâce à la formation d’un gradient de protons.

Elle est constituée de 4 complexes et une ATPsynthase qui assurent le transfert de protons et d’électrons :

Le complexe I: NADH - coenzyme Q oxydoréductase

Le complexe I catalyse le transfert de 2 électrons du NADH (formé au cours du cycle de Krebs) au coenzyme Q via la flavine mononucléotide et un ensemble de centres [Fe - S].

Le complexe II: succinate - coenzyme Q oxydoréductase

Le complexe II accepte deux électrons du succinate et catalyse la réduction du coenzyme Q en QH2, le succinate étant transformé en fumarate (c'est l'une des réactions du cycle de Krebs).

La réaction met en jeu le FAD, des centres [Fe - S] et le cytochrome b560 attaché au complexe II.

Complexe III: ubiquinone-cytochrome C réductase

Les électrons sont cédés par le complexe III au cytochrome c (différent du cytochrome c1) qui les amène au complexe IV.

Complexe IV : cytochrome c oxydase

Le complexe IV est le dernier de la chaîne de transport d'électrons : il catalyse la réduction de l'oxygène moléculaire en eau: O2 + 4 H+ + 4 e- ---> 2 H2O

Atp synthétase : Elle synthétise l’ATP à partir de l’ADP+Pi lorsqu’il y a un gradient un gradient de protons. 3 protons sont nécessaires pour synthétiser une molécule d’ATP.

Ce flux d’électrons est couplé à un gradient de protons. On dit que les mitochondries possèdent un phénomène de couplage. En effet le transfert d’électrons conduit à un pompage de protons à partir du cytosol. Une force protomotrice est alors générée. Par suite ces protons retournent dans la matrice mitochondrial en passant à travers l’ATP synthétase. Ce flux de protons active le complexe protéique et permet ainsi la synthèse d’ATP à partir d’ADP. L’ensemble de ces phénomènes couplés constitue le processus de phosphorylation oxydative.

Oxygraphie :

Le but de ce TP est d'étudier le fonctionnement de la chaîne respiratoire de mitochondries. Le foie étant un tissu particulièrement riche en mitochondrie, nous l'utiliserons pour cette étude. Pour comprendre le fonctionnement de la chaîne respiratoire, nous utiliserons un oxygraphe pour suivre l'évolution de la concentration en oxygène au cours du temps.

L’oxygraphe est un des appareils de mesure qui utilise une électrode à dioxygène constituée par une cathode et une anode reliée par une solution conductrice. L'ensemble est séparé du milieu par une membrane imperméable à l'eau et aux ions mais perméable au dioxygène dissout. L'électrode est polarisée. On enregistre le courant électrique généré. L'intensité du courant est proportionnelle à la quantité d'oxygène dissoute dans le milieu. On

peut ainsi suivre la consommation d'oxygène qui est l'accepteur final de la chaîne respiratoire. Grâce aux tracés obtenus nous pourrons calculer la pente et donc en déduire la vitesse de la réaction.

La spectrophotométrie :

Elle nous permet de mesurer l’absorbance d’une substance chimique donnée dans une solution colorée par un faisceau lumineux ayant une longueur d’onde de 340 nm. On utilise la longueur d’onde de 340 nm car le produit de la réaction NADPH absorbe dans cette longueur d’onde.

Résultats:

1/- Mesure de la consommation d’oxygène d’une suspension de mitochondries:

Nous voudrions juste préciser avant d’exploiter et de présenter les résultats que la sensibilité de notre oxygraphe était très faible ; nous avons donc obtenu des pentes très peu différentes nous obligeant parfois à laisser plus de temps entre les injections pour bien observer l’effet escompté.

Une pente plus importante sur nos tracés signifie une vitesse de consommation d’oxygène plus importante.

Dans tous nos tracés, nous ajoutons des mitochondries dans notre tampon de respiration. Nous allons donc juste les étudier préalablement une fois car le mécanisme est le même pour tous nos tracés.

Ajout de 1,5mL de tampon de respiration : Nous n’avons aucune variation de la quantité d’oxygène car le tampon est notre milieu contenant 100% d’oxygène et aucune réaction ne s’est alors déroulée.

Ajout de (10 ou 15µL) de mitochondries : Après l’injection on remarque une augmentation légère de la quantité d’oxygène consommée ; ceci s’expliquant par l’utilisation du pouvoir réducteur résiduel des mitochondries qui font fonctionner la chaîne respiratoire à court terme.

Tracé 1 et tracé 2 :

Les tracés 1 et 2, mettent en évidence la théorie chimio-osmotique de la chaine respiratoire. Ils nous permettent d’observer l’action du succinate (activant le complexe II) et du glutamate-malate (activant le complexe I). On observe donc les deux voies séparément.

La première voie comprenant les complexes I, III et IV et la deuxième voie, les complexes II, III et IV.

Tracé 1:

Ce tracé nous permet d’étudier l’action de succinate sur la chaine respiratoire. Lorsque nous injectons le succinate, nous observons une vitesse de consommation d’oxygène plus importante. La pente après l’ajout de succinate est appelé état IV.

Ce phénomène est explicable au niveau de la chaîne respiratoire des mitochondries ; le succinate injecté se réduit en fumarate avec l’oxydation couplée du FAD en FADH2 en suivant la réaction suivante:

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