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Compte Rendu TP électrophorèse De Protéines

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Par   •  14 Octobre 2014  •  2 005 Mots (9 Pages)  •  5 615 Vues

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TP ELECTROPHORESE DE PROTEINES

I BUT

Le but de ce TP est de contrôler l’extraction du lysozyme effectuée au premier TP. Pour se faire nous ferons une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en condition dénaturante ainsi qu’un imunomarquage afin de vérifier la pureté de nos lysozymes.

II PRINCIPES

Electrophorèse :

L’électrophorèse est une technique analytique ayant pour but de séparer des molécules chargées au travers d’un gel (un polymère) servant de tamis moléculaire sous l’effet d’un champs électrique. En fonction de différents paramètres (charge, masse, forme, nature du support, conditions physico-chimiques) la vitesse de migration va être variable, ce qui permet la séparation des différentes molécules. A partir de ce principe général, il existe plusieurs variantes de cette technique adaptées à différentes situations.

Pour ce TP nous utilisons une électrophorèse de gel de polyacrylamide (mélange 30% acrylamide et 0.8% bis acrylamide) en condition dénaturante.

L'électrophorèse en conditions dénaturantes est une méthode analytique qualitative reposant sur la séparation des protéines en fonction de leur poids moléculaire.

Le support sera le gel polyacrylamide et nous appliquerons à nos échantillons des agents dénaturants : soit une solution contenant du Tris-HCl, du SDS, du glycérol soit une solution contenant ces mêmes constituants avec du β-mercaptoethanol en plus.

Le gel de polyacrylamide est obtenu par polymérisation d'acrylamide qui forme des chaînes et de bis-acrylamide qui ponte les chaînes d'acrylamide.

Le polyacrylamide forme une structure poreuse jouant le rôle de tamis moléculaire dont la taille des pores dépend de la concentration en acrylamide (T) et du facteur de pontage. Donc ici plus la concentration en acrylamide augmente, plus les pores seront petits et sépareront de plus petites molécules.

La valeur moyenne des mailles est inversement proportionnelle à la racine carrée de la concentration totale et elle dépend de la concentration totale en acrylamide, T et du pourcentage en bis-acrylamide (facteur de pontage C).

En faisant varier le pH de la solution de Tris-HCl et la concentration en acrylamide nous pourrons créer 2 gels différents : un gel de concentration et un gel de séparation.

Le gel de concentration est peu concentré et ses mailles sont larges (elles n’influenceront donc pas la migration des différentes espèces). Avec un pH de 6.8, les ions chlorures sont chargés et pousserons par répulsion ionique (sous un champ électrique) les protéines qui se concentrerons en une bande fine. C’est l’isotachophorèse.

Le gel de séparation est lui moins acide, et ses mailles sont plus petites car il est plus concentré en polyacrylamide. Ainsi le gel joue le rôle de tamis, en ralentissant les protéines les plus grosses alors que les plus petites pourront passer au travers des mailles.

Le SDS (sodium dodécylsulfate) est un détergent ionique qui dénature les protéines en enveloppant la structure primaire des polypeptides. Il leur confère une charge négative proportionnellement à leur longueur ainsi toutes les protéines seront chargées négativement (on dit qu'on obtient des micelles de polyanions) et migrerons donc toute vers le pole +. Il en résulte qu'en présence de SDS la seule variable qui différencie les protéines est la masse moléculaire.

Le ß-Mercaptoéthanol est un réducteur qui réduit les ponts disulfures ce qui permet, en présence de SDS, une dénaturation totale des protéines et de séparer deux polypeptides associés par ce type de liaison covalente.

Afin d’identifier les structures des molécules purifiées nous utilisons donc ce deuxième agent dénaturant. En comparant une migration par électrophorèse effectuée sans β-mercaptoéthanol et une autre effectuée avec, nous pourrons proposer une structure tertiaire et quaternaire des protéines (nombres de sous-unités).

La coupure des ponts S-S fera apparaître les protéines en plus petits fragments, ce qui fera que les sous unités de la protéine migreront plus vite et en fonction de leur distance de migration.

Le Bleu de Bromophénol est un composé acidobasique dont la forme basique est de couleur bleu. Il possède une vitesse de migration comparable à celle des protéines, sa coloration va donc permettre de suivre l’évolution de la migration et de l’arrêter lorsqu’il aura atteint le bord inferieur du support.

Le Glycérol va augmenter la densité de l’échantillon permettant à celui-ci de se déposer facilement au fond des puits.

Colorations :

Pour pouvoir visualiser les protéines ayant migrées sur le gel, il est nécessaire de les colorer. Nous réalisons donc une coloration au Bleu de Coomassie. Le bleu de coomassie est un colorant non spécifique et irréversible. En plongeant le gel dans de colorant il y a une fixation du colorant sur les protéines et une dénaturation définitive de ces dernières. Cette coloration permet de visualiser tous types de protéines présentes sur le gel.

Imunomarquage :

Afin de détecter la présence d’une protéine précise (ici le lysozyme), on utilise la méthode d’imunomarquage qui se déroule en deux étapes :

- Un électrotransfert des protéines du gel vers une membrane

- Une immunorévélation

1. L’éléctrotransfert.

Le gel de polyacrylamide est fragile et la taille de ses pores ne permet pas une diffusion suffisante, les protéines doivent donc être transférées depuis le gel de migration sur une membrane de nitrocellulose afin d’être exposées ultérieurement à un anticorps spécifique de la protéine d'intérêt.

Ce déplacement de protéine, est réalisé à l’aide d’un transfert par électrophorèse.

On applique une membrane de nitrocellulose sur le gel, que l’on fera baigner dans un tampon d’électrotransfert, facilitant le passage d’un courant électrique. Le champ électrique sera appliqué perpendiculairement à l’ensemble gel/membrane.

Le SDS ajouté précédemment a

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