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Compte-rendu TP Spécificité des actions enzymatiques : les glycosidases

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Par   •  5 Octobre 2018  •  TD  •  1 292 Mots (6 Pages)  •  582 Vues

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Biochimie expérimentale

Compte-rendu de TP

Spécificité des actions enzymatiques : les glycosidases

  1. BUT DU TP

Le but de ce TP est de déterminer la structure d’un diholoside inconnu. Pour ce faire, les principales étapes sont :

  1. l’action enzymatique spécifique de 4 glycosidases
  2. l’identification des oses libérés grâce à une chromatographie sur couche mince
  3. la  mise en évidence de l’éventuel pouvoir réducteur du diholoside grâce au test de la liqueur de Fehling

  1. PRINCIPE DU TP

L’action des glycosidases : hydrolyse enzymatique

Un diholoside résulte de la condensation de 2 oses liés par la formation d’une liaison osidique. Afin de séparer les oses, les liaisons osidiques peuvent être hydrolysées par des exo-enzymes spécifiques appelées glycosidases.

Elles sont très spécifiques et possèdent différents paramètres de sélection : l’ose qui a engagé son OH anomérique dans la liaison osidique hydrolysée, la nature de l’ose, sa série (D ou L), sa forme cyclique (pyrane ou furane) et l’anomérie de la liaison osidique (alpha ou beta).

De ce fait, si le diholoside inconnu est mis en présence et réagit avec une enzyme de nature connus, il est possible d’identifier le ou les oses composant le diholoside : l’ose « associé » à l’enzyme sera présent.

La chromatographie sur couche mince (CCM)

La chromatographie sur couche mince est une chromatographie d’adsorption.

La chromatographie sur couche mince est une technique de séparation des molécules basée sur les différences d’interaction des substances à l’égard de deux phases :

  • Une phase stationnaire (ici, une plaque de gel de silice préalablement imprégnée de Na2HPO4 = hydrogénophosphate de sodium)
  • Une phase mobile nommée éluant (ici, acétone-eau en proportion 9 :1)

Les molécules sont séparées en fonction de leur polarité. Mise au contact de la phase stationnaire, la phase mobile migre par capillarité entraînant avec elle les composés déposés préalablement (phénomène d’élution). + la molécule sera polaire, + elle sera retenue par l’adsorbant polaire (gel de silice). A l’inverse, + la molécule sera apolaire, + elle sera entraînée par le solvant et migrera.

La grandeur caractéristique de la séparation des molécules est la distance de migration appelée rapport frontal Rf. Rf : d/ D avec

d = distance de migration de la tache (de la ligne de dépôt jusqu’à la tache)

D = hauteur du front du solvant

Plus le rapport frontal sera élevé, + la molécule aura migrée et + elle sera apolaire.

Afin d’identifier les oses, il convient de comparer les rapports frontaux obtenus à ceux des sucres « témoins » (de nature connue).

Test à la liqueur de Fehling

Le test à la liqueur de Fehling permet de mettre en évidence l’éventuel pouvoir réducteur d’une molécule (présence d’une fonction réductrice= fonction aldéhyde dans le cas des sucres).

La liqueur de Fehling est un indicateur coloré cad une substance chimique qui réagit en présence d’une autre substance en changeant de couleur.

Il s’agit d’une solution contenant notamment des ions cuivre II (Cu 2+), ayant une couleur bleue en milieu basique. En milieu basique, à chaud et en présence d’une substance réductrice, la liqueur de Fehling conduit à la formation d’un précipité rouge brique (Cu2O) après oxydation de l’aldéhyde (dans notre cas) par les ions cuivre. Le Cu20 obtenu correspond donc a du cuivre oxydé. Le diholoside est dit réducteur et le test est positif.

A l’inverse, si aucun précipité rouge brique n’apparaît, cela indique que la molécule ne contient aucune fonction réductrice.  

  1. RESULTATS

Résultats de la chromatographie

Après hydrolyse du diholoside inconnu par 4 glycosidases (la beta-D-glucopyranosidase, la beta-D-fructofuranosidase, l’alpha-D-glucopyranosidase et la beta-D-galactopyranosidase), nous avons analysé les produits obtenus par CCM.

On précise que :

  • le pH du tampon est différent selon les tubes afin que les hydrolyses enzymatiques soient réalisées au pH d’activité optimale des enzymes.

  • Une fois la CCM terminée, il a été procédé à la révélation des sucres par l’action de plusieurs composés : l’acide malonique, l’aniline, l’acide phosphorique et l’éthanol. Ces révélateurs de sucres donnent une coloration brune aux différentes taches.

Voici le chromatogramme original :

Voici le schéma du chromatogramme obtenu :

Calculs des rapports frontaux :

N° de la tache

Composition

d (en cm)

D (en cm)

Rf (avec Rf = d/D)

1

D-Glucose

(10 dépôts)

3,3

7,6

0,42

2

D-Galactose

(10 dépôts)

2,5

7,9

0,31

3

D-fructose

(15 dépôts)

4,7

8,1

0,58

4

Tube 1

Diholoside + tampon pH = 4,8

1,6

8,2

0,195

5

Tube 2

Diholoside +

Tampon pH = 4,8 +

Β-D-Fructosidase

1,9

8,2

0,23

6

Tube 3

Diholoside + tampon pH = 4,8 +

Β-D-Glucosidase

1,5

8,3

0,18

7

Tube 4

Diholoside + tampon pH=6,4

𝛼-D-Glucosidase

4

8,4

0,47

8

Tube 5

Diholoside + tampon pH=7,2

+  𝛼-D-Galactosidase

2

8,4

0,23

9

Mélange des 3 sucres (Glc, Gal et Fru)

4/ 5,3/ 6,5

8,5

0,47/ 0,62/ 0,76

...

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