Technique d'étude de la cellule

UE2 Biologie Cellulaire

Carole Amant

Cours n°1

Techniques d’étude de la cellule

Imagerie cellulaire

Résolutions :

œil nu : 300 µm (10-6m)

microscope optique : 200 nm (10-9m)

microscope électronique : 100 pm (10-12m)

Trois types de microscopie optique :

Lumière directe / contraste de phases

A fluorescence : faisceau laser à la place de la lampe

Confocal à fluorescence

Deux types de microscopie électronique :

A transmission (MET)

A balayage (MEB)

Microscopie optique

Préparation des échantillons

Microscopes optiques :

Lumière directe : on ne voit pas les cellules vivantes. (pas de relief ni de contraste)

Contraste de phase : meilleure vision.

Fluorescence :

Lampe à vapeur de mercure. Généralement pour des cellules mortes.

Ex : coloration de spermatozoïdes : bleu pour la tête (colorant), vert pour le flagelle. (anticorps marquant les mitochondries)

Parfois la fluorescence n’est pas nette, elle est trop diffuse. La membrane est alors mieux vue en confoncal.

Différents types de fluorescence :

Substance naturelle se fixant spécifiquement sur certaines substances. Ex : DAPI sur ADN -> bleu

Substance non spécifique accrochée à un anticorps qui se fixe à un antigène. ex : fluorescéine (verte) ou rhodamine (rouge). Naturelle. Spécificité due à l’anticorps.

Fluorescence à partir du ver luisant ou de la pieuvre. Immunofluorescence : l’anticorps est marqué, couplé à un fluorophore, se fixe sur l’antigène ; Est observé en fluorescence. Ne peut pas faire la différence entre la membrane et le cytoplasme.

Intégration d’une séquence codant pour la protéine naturellement fluorescente. ex : GFP provient du ver luisant. En fait, OGM. Ex : maïs, à côté du gène de résistance on insère le gène fluorescent.

Souris fluorescentes : permet de repérer les homozygoties.

GFP : green fluorescent protein. La protéine synthétisée comporte une protéine fluorescente. Ex : cellule rénale transfectée.

Techniques utilisant la fluorescence :

Immunofluorescence

Protéines chimères GFP

FISH : fluorescence in situ hybridation : permet de repérer des anomalies chromosomiques comme des translocations. (le gène peut se retrouver coupé de son promoteur ou associé à un autre promoteur).

Confocal à fluorescence

Le foyer a la même profondeur mais la profondeur de collecte de lumière est la même que celle du foyer. On n’observe qu’un seul plan d’étude. Permet des images nettes et précises. Permet de disséquer la cellule en observant ces différentes épaisseurs.

Microscopie électronique

On projette un faisceau d’électron. Les échantillons sont toujours morts. Il faut une préparation spéciale. On utilise des sels de métaux. Par dépose perpendiculaire : coloration négative. Vaporisation oblique : coloration positive.

Cryofracture : échantillon congelé. Coupe oblique : déchirement de l’échantillon : création de creux et de bosses. Pulvérisation de sels de métaux lourds. Observation des ombres/reliefs d’échantillon.

MEB : balayage sur l’ensemble du tissu. Image en relief.

Isolement et culture des cellules

A partir d’un tissu

Tampon = trysine + edta -> donne tissus ou cellules adhérentes en culture -> On les dissocie par trituration mécanique. Les cellules sont en suspension. On les centrifuge ce qui donne dans le surnageant : le tampon et les enzymes ; les débris se retrouvent dans le culot. Les cellules sont remises en suspension, puis on les sépare.

Ex : kératinocytes poussant à partir d’un explant de peau.

A partir du sang

Le sang hépariné (l’héparine est un anti-coagulant) est centrifugé.

Culture cellulaire

Le fragment tissulaire broyé est placé dans un flacon rempli de milieu nutritif et d’enzymes qui séparent les cellules les unes des autres. Après centrifugation, les cellules sont placées dans une culture primaire où elles prolifèrent jusqu’à confluence (le milieu devient acide (jaune au lieu de rouge) lorsqu’il y a trop de cellules). On opère alors un passage : les cellules sont récoltées et transférées dans un nouveau flacon qui forme une culture secondaire. On leur applique des enzymes qui détruisent les molécules d’adhésion.

Le nombre de passages possibles avant que la culture de cellules soit inutilisable varie selon les cellules. Ex : 4 ou 5 passages pour des kératinocytes, une cinquantaine pour des cellules cancéreuses.

Tri cellulaire par cytométrie en flux

Cytométrie en flux (taille, granulosité) et cytofluorimétrie (taille, granulosité, fluorescence)

On fait en sorte d’individualiser les cellules. On met le tube sous la pipette, elle absorbe les cellules une par une. Puis les cellules passent devant un faisceau laser. 3 détecteurs : deux sur le côté et un à l’arrière ; ceux sur les côtés sont proportionnels

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