Mutagénèse

Compte Rendu  

TP de génétique

Introduction générale sur le modèle utilisé

La levure Saccharomyces Cerevisiae est un micro-organisme eucaryote unicellulaire capable de se multiplier sous deux formes, haploïde ou diploïde. Elle possède 400 origines de réplication, 16 chromosomes à l’état haploïde, soit 32 chromosomes dans son état diploïde ainsi que 14.106 paires de bases. Ainsi, son cycle cellulaire peut s’accomplir par reproduction sexuée ou asexuée. Les cellules haploïdes peuvent être des cellules a ou des cellules 𝛂 qui donnent des cellules filles à l’information génétique identique par bourgeonnement (mitose). S’ensuit une fusion de ces cellules filles pour donner une cellule diploïde. Cette dernière, tant que l’environnement reste favorable, se multiplie par bourgeonnement. Si les nutriments deviennent insuffisants, elle repasse à l’état haploïde à travers le processus de sporulation impliquant une méiose. Cela produit donc 4 haploïdes contenus dans des spores entourés d’une enveloppe. Lorsque celle-ci se rompt, il y a libération de deux cellules a et deux cellules 𝛂.  

Cette levure possède donc quelques avantages qui font d’elle un organisme modèle en biologie et notamment en génétique. Nous pourrons notamment citer son génome assez petit et facile à séquencer, sa facilité à pousser sur boite de Pétri avec gélose ou en culture, son cycle rapide ou encore sa capacité à vivre sous forme haploïde ou diploïde. Ce dernier atout est particulièrement intéressant en génétique afin d’effectuer des croisements et observer facilement les phénotypes.  

Nos expériences seront donc réalisées sur des souches haploïdes, afin d’étudier les mutations ainsi que les phénotypes associés. Lorsqu’il y a un changement dans l’ADN, et qu’il entraine une modification au niveau du phénotype, celle-ci est facilement repérable. Il s’agira dans un premier temps d’une mutagenèse aux UV dont nous étudierons les conséquences en terme de survie et de phénotypes. Suite à cela, un test de complémentation sera réalisé sur des mutants issus d’un mutagenèse différente, dont nous effectuerons l’analyse génétique.  

Mutagenèse

1. Introduction sur le principe 

Une mutagenèse conduit à l’apparition de mutations. Elle peut être naturelle ou réalisée artificiellement à l’aide d’agents mutagènes qui augmentent le taux de mutations, et donc la fréquence des mutants. Les UV sont de puissants agents mutagènes, au niveau de l’ADN ils induisent la formation de dimères covalents entre des thymines voisines dans le brin d’ADN. Les dimères formés bloquent la réplication et peuvent conduire à des mutations. Des systèmes de réparation sont mis en jeu pour éliminer ces dimères et resynthétiser le brin d’ADN muté mais ils ne sont pas complètement efficaces.  

Il s’agit d’une mutagenèse au hasard qui aboutit à une population hétérogène dans laquelle les levures vont porter des gènes mutés. Ici on fait la mutagenèse sur des levures haploïdes afin de suivre correctement les mutations et les gènes impliqués.  

2. Question posée 

La question que l’on se pose ici est de savoir quelles sont les conséquences de l’irradiation à différentes doses d’UV sur la survie des levures et sur la réversion phénotypique. Autrement dit, est ce que, en induisant des mutations, nous pouvons retrouver la souche de référence de ces levures?

3. Principe expérimental 

Cette première expérience consiste à étudier sur une souche de Saccharomyces cerevisiae, les effets des radiations UV sur la survie et sur le taux de mutation. Pour cela, nous utilisons une souche auxotrophe pour l’adénine [ade-]. Rappelons que l’auxotrophie correspond à l’incapacité pour organisme vivant à synthétiser un composé organique nécessaire à son développement ou sa survie, ici l’adénine donc.  

Ainsi, la souche présente une mutation ade 2-1 dans le gène ADE2. Ce dernier intervient dans la voie de biosynthèse de l’adénine. Cette mutation, en interrompant la voie, conduit à l’accumulation d’un intermédiaire de la biosynthèse de l’adénine. Lorsqu’il est oxydé par les mitochondries, il acquiert une couleur rose/rouge caractéristique et facilement observable dans nos boites de Pétri contenant des colonies de cette souche. Notons, en revanche, que la souche de référence présente une couleur blanche.  

Nous débutons avec une première phase, au cours de laquelle nous avons 200 μL de culture liquide de levures qui ont été diluées à 1/10, 1/100, 1/1000 et 1/10 000. La dilution permet de faciliter le comptage en évitant des colonies trop nombreuses. Après avoir noté derrière chaque boite la dilution correspondante et le temps d’exposition aux UV, nous avons étalé sur les boites contenant un milieu nutritif complet les 200 μL de chaque dilution à l’aide de billes stériles. Après cela, les boites ont été mises sous lampes et  exposées aux UV  selon des temps différents (0s, 3s ou 6s). L’étape suivante consiste à incuber les boites à 30°C pendant 72h avant de les conserver à 4°C.  

La phase suivante consiste à observer les boites afin de déterminer dans un premier temps les éventuels problèmes de croissance, des contaminations qui auraient pu survenir lors de la mise en boite… Nous pouvons ensuite procéder au comptage de l’ensemble des colonies présentent sur les boites et repérer les phénotypes présents (couleur, taille des colonies…). Ces observations sont alors reportées sur un tableau regroupant l’ensemble des boites de l’expérience.  

4. Description et analyse des résultats 

On remarque que plus les colonies sont exposées aux UV, moins elles sont nombreuses. Cela signifie que les UV entraînent une mutation non viable qui conduit les cellules à entrer en apoptose. De plus, on observe une concentration des levures au niveau des bords des boites de Pétri, car les parois les ont partiellement protégées des UV.  Cependant, on peut observer une augmentation des colonies blanches selon le temps d’exposition aux UV. Si les colonies rouges deviennent blanches après exposition, c’est qu’il y a eu mutation de ces levures après avoir été exposées à l’agent mutagène.  

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