LaDissertation.com - Dissertations, fiches de lectures, exemples du BAC
Recherche

La Technique Du Knock-out

Commentaires Composés : La Technique Du Knock-out. Recherche parmi 297 000+ dissertations

Par   •  6 Novembre 2012  •  1 313 Mots (6 Pages)  •  2 249 Vues

Page 1 sur 6

La technique du knock-out chez un organisme modèle : Mus Musculus

Introduction :

Ce fut en 1987 que des équipes britanniques démontrèrent la possibilité d’invalider de façon ciblée un gène dans les cellules souches embryonnaires et d’introduire la mutation correspondante dans la lignée germinale d’une souris. Ainsi est née la notion de Knock-Out. Cette technique a été développée pour la première fois sur la souris, un cobaye qui constitue un modèle expérimental idéal. En effet, ces animaux, porteurs de mutations facilement identifiables, permettent de faire des croisements dont les résultats sont aisément interprétables. C’est donc avec l’espèce Mus Musculus que nous allons illustrer la technique du Knock-Out.

Notre exposé s’effectuera en trois temps avec une première partie consacrée au principe et à l’intérêt de la méthode KO, une deuxième partie décrivant sa mise en œuvre et enfin une application possible à l’étude d’un problème du développement.

I. Le Knock-out : mutagenèse dirigée dans les cellules souches embryonnaires

Le principe de cette technique réside dans l’invalidation d’un gène au niveau de cellules souches embryonnaires (cellules ES) appelées alors cellules ES KO. Ces dernières vont être ensuite injectées dans un embryon à un stade précoce du développement. Par croisement de la descendance, les souris dites KO sont obtenues.

Ainsi une souris portant une mutation nulle dans le gène d’intérêt (gène étudié) présente un phénotype indiquant à quel stade, dans quels tissus ou dans quel organe la fonction du gène est importante. La technique du Knock-Out permet donc de déterminer la fonction du gène invalidé au sein un organisme normal (ici la souris). En présence d’une anomalie phénotypique il est alors possible d’identifier le gène responsable.

De plus, lors d’un KO on peut réaliser une mutagenèse ciblée ou une mutagenèse conditionnelle. La mutagénèse ciblée est «classique » : mutation ciblée sur un locus. Mais si cette mutation entraine la mort de l’embryon il est alors impossible d’étudier la fonction du gène. Pour contourner cet inconvénient on a recours à la mutagénèse conditionnelle : la mutation est effectuée dans un tissu précis afin d’étudier les effets de l’absence dans ce seul tissus.

Transition

Comme nous avons pu le voir précédemment, le Knock-Out consiste à remplacer un gène dans des cellules souches embryonnaires par un allèle muté. L’objet de notre deuxième partie sera l’étude de la technique à partir de l’insertion de cellules souches embryonnaires mutées dans un blastocyste jusqu’à l’obtention de souris transgéniques homozygotes pour le gène d’intérêt.

II. Des cellules souches embryonnaires mutées à la souris transgénique

Les blastocystes dans lesquels sont injectées les cellules ES KO ont été cultivés in vitro depuis le stade œuf fécondé jusqu’au stade jeune embryon, ce sont des blastocystes qui sont à l’origine des souriceaux noirs. L’injection de cellules ES dans un blastocyste est une manipulation délicate réalisée sous microscope à l’aide de deux appareils de micromanipulation :

- l’un pour le maintien du blastocyste hôte.

- l’autre pour la manœuvre de la micropipette avec laquelle 15 à 25 cellules vont être aspirées puis injectées dans le blastocœle de l’embryon hôte. Les cellules souches embryonnaires s’incorporent à celles de l’embryon, et participent à la formation des tissus et des organes.

Il y a ensuite transfert des blastocystes dans l’utérus d’une femelle receveuse, et seulement 25% des blastocystes transférés se développeront à terme et donneront des individus dits chimères (hétérozygotes pour la mutation étudiée). Le caractère chimérique est identifiable à l’œil nu car l’expérimentateur prend la précaution d’utiliser des lignées de cellules ES portant les gènes dominants qui assurent une couleur brune au pelage tandis que les blastocystes n’ayant pas reçus les cellules ES KO donnent des souriceaux noirs. Ainsi, les chimères sont ceux qui ont un pelage noir parsemé de taches brunes.

Parmi les individus chimères, certains ont intégrés la mutation dans leur cellule germinale c’est-à-dire qu’ils sont capables de transmettre leur mutation à leur descendance. En principe, on

...

Télécharger au format  txt (8.8 Kb)   pdf (99 Kb)   docx (11.4 Kb)  
Voir 5 pages de plus »
Uniquement disponible sur LaDissertation.com