Étude de la cinétique d'hydrolyse de l'ONPG par la β-Galactosidase

ETUDE DE LA CINETIQUE D’HYDROLYSE DE L’ONPG PAR LA β-GALACTOSIDASE

La β-galactosidase est une enzyme présente librement dans le cytoplasme de la bactérie E. coli. C’est une hétérotétramère de 464 kDa. Cette enzyme hydrolyse le lactose en du galactose et du glucose.

Lors de cette expérience, pour purifier l’extrait de départ et arriver à l’extrait B attendu, nous avons utilisé la sonication dans du tampon Tris-HCL 20mM à pH 8. Cette technique physique utilise les ultrasons afin de briser les membranes bactériennes. S’en suit une centrifugation afin de séparer le culot (partie insoluble) du surnagent (partie soluble contenant des acides aminés, des acides nucléiques, des nucléotides, de l’ADN, de l’ARN entre autres).

Une endonucléase coupe les ADN en oligonucléotides et en nucléotides dans le culot restant.

La dernière étape consiste à dialyser le culot dans du tampon Tris-HCL 20mM à pH 8 afin d’éliminer les molécules de masse moléculaire inférieure à 12 kDa présents via des pores prévues à cet effet.

Le but de cette expérience, dans un premier temps, est de déterminer l’influence de la quantité d’enzyme sur la vitesse initiale d’hydrolyse de l’ONPG, puis de déterminer l’activité β-galactosidase de l’extrait B pour au final trouver les cinétiques d’hydrolyse de l’ONPG.

1er Partie

On remplacera ici le lactose par un substrat synthétique, l’orthonitrophenol-β-D-galactose (ONPG), qui réagira pour donner de l’orthonitrophenol (ONP). L’ONP absorbe à 420 nm. On pourra donc suivre, via spectrophotométrie, la réaction d’hydrolyse et donc la vitesse de formation de l’ONP ainsi que la vitesse de catalyse de l’enzyme.

N.B : Un spectophotomètre envoie un faisceau lumineux permettant de connaitre l’absorbance à une longueur d’onde donnée. La solution est absorbante si I < I0

Pour trouver le coefficient d’extinction molaire, εM, on s’aide de la loi de Beer-Lambert :

DO=C.L. εM

La détermination du εM de l’ONP permet de retrouver la concentration et donc la quantité présente.

εM(ONP) = DO/C.L = 0,241/10-4 = 2410 M-1 cm-1

c.f Tableau n° 1

2e Partie

Le principe de l’expérience consiste à varier le volume de l’extrait B, donc la concentration d’enzyme présente, et de voir son effet sur la vitesse initiale de l’hydrolyse de l’ONPG.

L’expérience est menée à température ambiante (25°C). Pour tous les essais, le volume final ainsi que la concentration en ONPG utilisées doivent rester constant. On utilise du tampon T pour garder le volume final constant.

c.f Graphe 1

Les courbes sont linéaires, ce qui montre que la densité optique est proportionnelle à la concentration.

c.f Graphe 2 et Tableau n° 2

Graphe 2 : C’est une droite passant par l’origine.

Relation liant la Vi à la quantité d’enzyme : Vi = Vmax x [S]/(KM x [S])

Ce graphe montre que plus il y a d’enzyme, plus il y aura d’interaction enzyme-substrat et donc plus la probabilité de former les produits est grade.

3e

...