Spécificité des actions enzymatiques : Les glycosidases

TP LES GLYCOSIDASES

BUT

-En premier lieu nous devons déterminer la structure d'un diholoside inconnu ,pour ceci nous utiliserons des osidases différentes. Le résultat de cette hydrolyse sera appuyé par un test au liqueur de Fehling qui mettra en évidence la présence ou non d'un pouvoir réducteur.

Principe

-l'hydrolyse enzymatique est une réaction chimique qui fait intervenir une enzyme et une molécule d'H2O et conduit à la scission d'un composé

Ici nous utilisons des glycosidases qui catalyses la ruptures des liaisons osidique donnant ainsi suite à la libération de un ou plusieurs produits osidiques .

Cet hydrolyse enzymatique sera spécifique car elle réagit selon la nature de l'ose,de sa configuration anomérique (A et B),de la séries D ou L des oses et de sa forme cyclique (pyranique /furanique) .

nous pouvons donc déterminer les oses présents dans le diholoside en le faisant réagir avec plusieurs enzyme spécifiques déjà connu. En sachant que l'hydrolyse ne peut se produire qu'à conditions que tous les critères de spécificité sont respecté, si le polyosides réagit avec une des enzymes spécifiques on peut conclure que le sucre qui correspond à l'enzyme est présent dans le polyosides et qu'il est relié aux autres oses par les types liaisons spécifiques à l'enzyme qui à réagit .

Les produits obtenue après hydrolyses seront étudier par une chromatographie sur couche mince(CCM) .

La CCM est une technique de séparation des composés selon leur différence de polarité et de solubilité .elle se compose d'une phase mobile (souvent très polaire,éluant) et d'une phase stationnaire (moins polaire,plaque de silice) ou la phase mobile va faire migrer les composés qui sont sur la ligne de dépôt par capillarité le long de la plaque de silice .Une révélateur est alors utiliser pour faire apparaître nos composés ,ici c'est un mélange révélateur de sucres qui est utiliser.

-Après révélation nous calculons les rapport frontaux. Le rapport frontale Rh=h/H correspond a la distance de migration du composé (milieu de la tâche/h) divisé par la distance de migration du front de l'éluant (H) .En confrontant les différents rapport frontaux obtenus aux rapport frontaux témoins (glucose/fructose/galactose) ,si les rapport frontaux sont identiques on en déduit la présence de molécule identiques dans les composés déposés .

Le test à la liqueur de Fehling met en évidence la présence de pouvoir réducteur d'un composés osidiques. Un composé est réducteur lorsque sont OH anomériques est libre dans le polyosides c'est à dire ne fait pas parti de la liaison osidique. La liqueur de Fehling étant initialement bleu en absence de sucre réducteur ,devient rouge en présence de celui-ci.Cette réaction met en jeu le cuivre cu2+ ,de la liqueur réagissant avec le groupement hydroxyle anomérique qui se transforme en oxyde de cuivre donnant la couleur rouge brique .cette transformation à lieu lorsque le groupement OH n'est pas engagé dans la liaison osidiques.

Résultats interprétation 

résultat de la CCM : Après révélations nous avons calculer les rapport frontaux de chaque composés ainsi que des témoins pour voir les concordances :

-dépôt 2, diholoside + tampon à 4,8 + β-D-fructosidase Rf on obtient 3 tâche,une correspondant au glucose car une des tâche à un RF de 0,29 ,une correspondant au fructose car RF de 0,41 et une tâche qui est du même niveau et coloration que celle du tube témoin 1

-dépôt 3 (diholoside+tampon ph4,8+β-D-Glucosidase) : on obtient une seul tâche qui est au même niveau et de même coloration que le tube témoin (1)

-dépôt 4 (diholoside+tampon ph 6,4+α-D-Glucosidase) : ici nous avons 2 tâche ,une au même niveau et coloration que le glucose et une identique à celle du fructose

-dépôt 5(diholoside+tampon 7,2+α D-Galactosidase) : une seul tâche de même niveau et coloration que la tâche du tube témoins 1

d’après ces résultats on peut dire que dans le dépôt 2 la β-Dfructosidase à agi sur le diholoside et grâce à la spécificité des osidases on en déduit la présence d'un β-Dfructose de type furane dans le composé osidiques.

De même que pour le dépôt 4 ou était l' enzyme α-D-glucosidase. On observe que ce dernier a agi sur la liaison osidique du diholoside , il y a donc présence d'un α-D-glucose de type pyrane dans le composés .

L'observation des dépôt 3 et 5 est identique au dépôt 1 qui est le dépôt témoin ,donc il n'y a pas eu d' activité enzymatique ,cela veut dire que notre diholoside n'est pas composé de β-D-Glucose et de β-D-galactose .

D’après ces observation plusieurs structures peuvent

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