Méthodes biochimiques, la purification des protéines.

MÉTHODES BIOCHIMIQUES

• PURIFICATION DES PROTÉINES

Un préalable essentiel à l’étude des constituants des cellules est l’obtention d’une quantité suffisante et pure de la substance d’intérêt. C’est une lourde tâche car une cellule type contient des milliers de substances différentes. Les techniques d’isolement et de purification des molécules ont donc une importance considérable en Biochimie.

Pour une protéines, il faut de plus prendre des précautions pour éviter leur dénaturation (température, contact avec les peptidases du milieu originel, contact avec l’air…)

Les protéines sont purifiées par étapes indépendantes et en utilisant leurs différentes propriétés physico-chimiques. L’objectif est d’éliminer les molécules indésirables.

Les propriétés des protéines et des autres molécules biologiques exploitées pour leur purification sont :

• Leur solubilité (celle-ci est minimum au point isoélectrique de la protéine) : précipitation
• Leur taille : masse

• Leur charge nette à un pH donné

• Leur plus ou moins grande affinité pour la phase aqueuse (protéines hydrophiles, protéines hydrophobes)

• Leur capacité à se lier de façon spécifique à une autre molécule : affinité

Quelques techniques :

• Précipitation
• Dialyse

• Chromatographie sur papier
• Chromatographie par échange d’ions

• Chromatographie par gel-filtration

• Chromatographie d’affinité
• Chromatographie par interactions hydrophobes

• Electrophorèse
• Focalisation isoélectrique

• Ultracentrifugation

• SOLUBILITÉ DES PROTÉINES

Les protéines ont des compositions en AA différentes. Elles ont donc des propriétés différentes telles que la solubilité.

La solubilité est propriété largement utilisée pour isoler des protéines, celle-ci dépendant de plusieurs facteurs :

• pH

• Température

• Solvant utilisé
• Concentration en sels

Influence de la concentration en sels : une grandeur permet de quantifier la concentration en sels d’un solvant → force ionique notée I

I = ½ [pic 1]  iZi2

1

La solubilité dépend de la concentration ionique mais aussi de la nature des ions en solution. L’ordre d’efficacité des ions à solubiliser une protéine est essentiellement dû à la taille et à l’hydratation de l’ion et reste pratiquement le même pour différentes protéines.

[pic 2]

A faible force ionique, la solubilité d’une protéine augmente généralement avec la concentration en sel : salting-in. Le Salting-in

est dû aux nombreuses interactions électrostatiques favorables entre ions et charges de la protéine.

• PRÉCIPITATION DES PROTÉINES

A forte concentration (I élevé), les sels diminuent la solubilité des protéines et provoquent leur précipitation : salting out (relargage).

Résulte d’une compétition entre ions et protéines pour la solvatation. A un moment, beaucoup trop de molécules de solvant sont réquisitionnées pour les ions, les protéines perdent (au moins en partie) leur couche de solvant (eau)

→ précipitation

Avantage : la précipitation des protéines par les sels ne dénature pas les protéines. Méthode qui permet de purifier efficacement une protéine dans un mélange.

• PURIFICATION PAR SALTING-OUT

Dans l’exemple précédent, si I est amené à -7 -7,5, toutes les autres protéines vont précipiter sauf la myoglobine. Après filtration ou centrifugation, la concentration en sel est augmentée jusqu’à précipiter la protéine recherchée. Cette méthode est souvent utilisée comme point de départ.

NH4I2SO4 est largement utilisé du fait de sa très grande solubilité permettant la préparation de solution de I très élevé.

Certains ions augmentent la solubilité, tels que I-, ClO4-, SCN-, Li+, Mg2+, Ca2+, Ba2+ augmentent la solubilité des protéines. Ils peuvent aussi dénaturer les protéines.

A l’opposé, les ions qui diminuent leur solubilité stabilisent en même temps leur structure native : H2PO4-, SO42-, NH4-, K+, Na+

Influence du pH, en particulier :

• La protéine ne se déplacera pas lorsqu’elle sera placée dans un champ électrique (F = qE)

• Sa solubilité sera minimale au pI et augmente lorsque le pH varie de part et d’autre du pI

[pic 3]

Pour pH < pI et pour pH > pI, les protéines ont tendance à se repousser mutuellement.

Lorsque pH ~ pI, la charge nette portée par les protéines diminue, pouvant conduire à une précipitation (diminution de la solubilité).

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Influence des solvants organiques : miscibles à l’eau sont généralement de bons agents qui précipitent les protéines car leur constante diélectrique abaisse le pouvoir de solvatation du mélange de solvants résultant.

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