Analyse physico chimique

Contexte :

Dans un laboratoire de recherche travaillant dans le domaine de la microbiologie, le responsable d’équipe soupçonne un stagiaire en charge de la collection des différentes souches de micro- organismes d’avoir fait une erreur. Lors du repiquage, le technicien aurait inversé deux souches bactériennes, un Staphylococcus aureus et un Escherichia coli. Ennuyé par cette erreur, le responsable d’équipe tente de trouver une solution pour réparer et demande conseil à trois de ses collègues.

Le premier gère la plateforme de génétique. Il se rappelle avoir lu une publication relatant des amorces spécifiques à E. coli sur le gène 16S. Une PCR et une électrophorèse sur agarose suffiront à donner la réponse.

La seconde, spécialisée dans les aspects fonctionnels des communautés bactériennes pense qu’il serait plus simple de mettre en culture les souches sur un milieu sélectif ce qui va permettre la croissance d’une espèce lorsqu’on connaît ses exigences nutritionnelles ou lorsqu’on incorpore dans le milieu un inhibiteur chimique.

Le troisième collègue est responsable du pôle microscopie du laboratoire. Il propose de réaliser une coloration GRAM et une observation des différentes souches.

OBJECTIF DU TP :

Nous cherchons à déterminer si les deux souches ont été inversées. Pour cela, nous utiliserons 3 méthodes. Nous chercherons à déterminer laquelle de ces méthodes est la plus simple et efficace.

1ère méthode : l’Outil moléculaire

Cette méthode consiste en une extraction d’ADN. Nous cherchons à récupérer les bactéries et les laver afin de se débarrasser du milieu de culture, pour ensuite effectuer une PCR (Polymerase Chain Reaction) du surnageant qui contient le matériel génétique. Nous utiliserons 3 amorces sélectives pour Escherichia Coli, ce qui permettra d’amplifier les différentes souches d’E.Coli.

Pour vérifier s'il y a eu amplification ; les produits de PCR seront analysés par électrophorèse.

L’électrophorèse est une technique séparative de l’ADN ou des protéines en fonction de leur taille / poids moléculaire. On applique à notre échantillon un courant éléctrique. L’ADN étant chargé négativement, va migrer vers le pôle positif (la cathode). Les protéines sont préalablement dénaturées à l’aide de β-mercaptohéthanol qui permet de rompre les pont disulfures, et SDS qui permet de chargé négativement les protéines, qui pourront également migrer vers le pôle positif.

Cette migration s’effectue au travers d’un gel d’agarose ou de polyacrylamide.

Nous avons un tube annoté 1 et un tube annoté 2. Chaque tube contient une souche, nous cherchons à savoir s'il s’agit de la même souche ou alors de souches différentes.

Chaque étape sera donc effectuée simultanément pour les deux tubes :

Homogénéiser le milieu de culture à l’aide de l’appareil ci-dessous.

Prélever 1mL de culture dans un tube à centrifuger de 1,5ml : Nous prélevons à l’aide d’une micropipette P1000.

Centrifuger 5 minutes à 4000g. Nous obtenons le résultat ci-dessous.

Vider le surnageant (tout ce qui se trouve au-dessus du culot)

Ajouter 1ml de ddH2O (à l’aide d’une micropipette P1000).

Vortexer.

Centrifuger 5 minutes à 4000g

Vider le surnageant.

Recommencer l’étape : Ajouter 1ml d’eau ddH2O, vortexer, centrifuger 5 minutes puis vider le surnageant.

Ajouter 200μL (à l’aide d’une micropipette) de ddH20 au culot bactérien.

Congeler les échantillons à -80°C (

Chauffer les échantillons à 98°C

Recommencer une fois cette étape (congélation puis chauffage)

Centrifuger 5 minutes à 4000g.

Récupérer 100μL de surnageant dans un tube de 500μL.

Dans un tube de 200 μL, ajouter, à l’aide d’une micropipette, 2 μL de notre surnageant (préalablement vortexé).

Ajouter dans ce même tube les amorces, du ddH2O, et un Master Mix Qiagen. (Qui a un volume de 18 μL).

Les tubes sont ensuite placés (après agitation et centrifugation) dans un thermocycleur.

Dénaturation pendant 3 minutes à 96°C

Dénaturation pendant 30 secondes à 96°C

Hybridation pendant 30 secondes à 60°C

Elongation pendant 40 secondes à 72°C

« go to»étape 2 35x

Élongation pendant 5 minutes à 72°C.

Après électrophorèse, voici les résultats qui nous ont été communiqué :

⇔

Nous pouvons observer que pour nos deux souches, il y a amplification. Nos amorces étant séléctives pour E.Coli, nous pouvons en déduire qu’E.Coli est présente dans nos deux tubes. Jusque-là, les deux tubes semblent identique et aucune erreur de semblent avoir été commise.

2ème méthode : l’outil microbiologique

Dans cette 2ème méthode, nous allons utiliser les souches présentes dans nos boites de pétri, fournis par les intervenants de TP.

Nous allons faire deux observations différentes. Une observation macroscopique, qui correspond à une observation à l’oeil nu et une observation microscopique en effectuant une coloration de GRAM.

Observation

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