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Technique biologique

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Par   •  18 Décembre 2017  •  Cours  •  4 516 Mots (19 Pages)  •  562 Vues

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Techniques biologiques.

Outils pour la Cytologie et l’histologie – Etude des principales techniques.

Quelques définitions.

  • Cytologie : Etude microscopique de cellules isolées.
  • Histologie : Etude microscopique de tissus biologiques. Par exemple, observation de l’oignon.
  • Microscopie : « micro » = petit + « copie » = examiner.

On ne peut pas voir en-dessous de 1mm.

Quelques notions sur la vision.

  • Vision humaine limitée par le pouvoir séparateur de l’œil.
  • Pouvoir séparateur = capacité à séparer visuellement deux objets distincts.
  • Pour une vision de 10/10 pouvoir séparateur = angle 1/60ème de degré.

        Permet de distinguer deux points éloignés de 0,1 à 25cm.

  • Pour une vision de 1/10ème 

        1mm vu à 25cm de distance.

Intérêt de la microscopie.

  • Plus la distance d’observation est grande, plus les détails devront être grands pour pouvoir être observés : 1mm à 2,5m ; 1cm à 25cm, etc.
  • Etude histologique à l’œil nu permet de distinguer :
  • La couleur,
  • La forme,
  • La taille,
  • L’aspect général.
  • Etude microscopique viendra compléter : examen des cellules.
  • L’utilisation d’appareils grossissants est donc intéressante.
  1. Loupes
  1. Observation à la loupe à main.

Loupe à main : Outil utilisé pour augmenter le pouvoir séparateur de l’œil.

  • Composé d’une lentille biconvexe qui dévie les rayons lumineux.
  • 10 x < Grossissement < 20 x (grossissement entre 10 et 20).
  • Pour garder une trace de l’observation faite, utilisation d’un appareil photo possédant un objectif macro.
  1. Observation à la loupe binoculaire.

Loupe binoculaire : possède une lentille objectif près  de l’objet à observer.

  • Possède deux lentilles oculaires près des yeux.
  • 10 x < Grossissement < 300x (grossissement entre 10 et 300).
  • Pour garder une trace de l’observation faite, utilisation d’une binoculaire avec appareil photo.
  • Utiles pour la réalisation de dissections fines. On peut y faire des dissections plus précises, rechercher des parasites sur le scarabée. etc.
  • Observation le plus souvent de la surface des objets.
  • Pour l’observation d’organismes peu pigmentés et transparents, possibilité d’observer l’extérieur et l’intérieur de l’individu. On peut essayer de voir l’intérieur d’organismes transparents, comme les larves de poissons, etc.
  • Utilisation d’une lumière épiscopique ou diascopique.

Episcopique (épi = sur) : Permet d’observer des objets opaques en couleur en leur donnant un effet plus naturel.

Diascopique (dia = à travers) : Convient davantage à des échantillons translucides et transparents. Procure un meilleur contraste que l’épiscopique.

  1. Microscopie photonique.

Microscopie photonique = microscopie optique : Technique d’observation d’objets par l’utilisation d’un microscope dans lequel un faisceau de photons (de lumière) éclaire l’objet.

  • Basé sur le même principe que la loupe binoculaire mais profondeur de champ plus faible.
  • Grossissements plus importants que sur la loupe binoculaire (certains vont jusqu’à x 1 000).

Historique :

  • Antiquité : utilisation de globes de verre remplis d’eau pour grossir les objets et concentrer sur eux la lumière.
  • XIIIème siècle ; Elaboration de lentilles.
  • 1590 : Hans et Zacharias Janssen (père et fils : opticiens hollandais) : 1er microscope ?
  • 1609 ? Galilée (savant italien) : ochiolino : 1er microscope ?
  • Fin du XVIème siècle : Antoni Van Leeuwenhoek : microscopes artisanaux simples d’usage et de taille réduite  intérêt des biologistes.
  • Fin du XVIIème siècle : Christiaan Huygens (savant hollandais) : oculaire de Huygens qui corrige les aberrations chromatiques (amélioration de la couleur et de la netteté).
  1. Types de microscopes photoniques.
  1. Microscopie photonique simple.
  • Même principe que loupe binoculaire.
  • Grossissement plus important et moins de profondeur de champ.
  • Eclairage essentiellement diascopique (sauf cas particulier).
  • Objets observés par transparence  intérêt d’avoir des échantillons de petites tailles (épaisseur de l’ordre de quelques microns).
  • Echantillons observés vivants ou morts.
  • Echantillons observés colorés ou non.
  • La manipulation des éléments regroupés suivants :

Permet l’observation

Permet de rendre l’image nette

Permet de rendre l’image plus ou moins lumineuse.

  • L’ajout d’huile à immersion entre l’objet et l’objectif permet d’atteindre un grossissement 1 000.
  1. Microscopie à fluorescence.
  • Microscope photonique à fluorescence = épifluorescence.
  • Certains objets microscopiques sont fluorescents, c’est-à-dire qu’ils émettent sur une longueur d’onde pus courte (lambda = 200 à 300nm).
  • Nécessite d’avoir un éclairage spécifique (avec de fortes quantité de bleu et de violet).
  • Exemple : éclairage par un « brûleur » au Xénon ou brûleur HBO à vapeur de mercure.
  • Eclairage épiscopique
  • Lentille en quartz
  • Grossissement x 200
  • Quels types d’échantillons ?
  • Composés naturellement fluorescents chlorophylle ou polymères.
  • Ajout de marqueurs fluorescents (fluorochrome).
  • Etc.
  1. Microscopie photonique à contraste de phase.
  • Microscopie photonique à contraste de phase = microscope à interférence différentielle : largement utilisée pour l’observation de cellules vivantes.
  • But : amplifier les contrastes naturels.
  • Certaines régions des cellules apparaissent alors plus claires que d’autres  contrastes plus importants artificiellement
  • Bon pour l’observation d’organismes avec flagelles et cils.
  1. Microscopie photonique à fond noir.
  • Microscopie à fond noir.
  • Observation de cellules vivantes grâce à une augmentation des contrastes naturels.
  • Sont équipés d’une condenseur opaque qui ne laisse passer la lumière que de façon oblique sur l’objet.
  • Seuls les rayons réfléchis par l’objet seront captés par l’objectif.
  • Permet d’observer des objets dont la dimension est à la limite extrême du pouvoir séparateur et qui passeraient inaperçus avec des techniques ordinaires.
  • On visualisera les éléments brillants sur fond noir.
  • Problème : faible intensité lumineuse pour l’observateur.

  1. Préparation du matériel pour la microscopie photonique.

  1. Matériel vivant
  • Préparation d’un matériel vivant différente d’une préparation d’une coupe histologique (protocole d’observation d’une matériel vivant plus simple).

Matériel vivant : Cellules isolées comme des frotis frais, des spermatozoïdes, du sang, des tissus végétaux, etc.

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